Диссертация (Взаимодействие молекулы ДНК с синтетическими аналогами антибиотиков и алкалоидов различной структуры), страница 5

В то же время в работах[90,91] было предположено размещение молекулы берберина в малой бороздкеДНК.Рис.1.12. Структура берберина [77].Процесс взаимодействия берберина с ДНК является экзотермическим ивыгодным как с точки зрения энтальпийной, так и энтропийной составляющей[86].Позднее было показано, что берберин и близкий к нему по структуреалкалоид пальматин связываются с ДНК различным образом в зависимости отАТ- и ГЦ-состава полинуклеотида [92].Синтетическим аналогом протоберберинов является коралин (рис.1.13). Этосоединение также обладает противоопухолевой активностью, но его токсичностьниже [93,94].

Противоопухолевая активность коралина связана с ингибированиемфункций фермента топоизомеразы I.27Рис.1.13. Структура коралина.Анализ связывания коралина с ДНК методами спектрофотометрии,кругового дихроизма, калориметрии показал, что при малом соотношенииконцентраций лиганд-ДНК, он интеркалирует в двойную спираль [88,95], однакос ростом концентрации соединения в растворе образуются внешние агрегатывдоль макромолекулы, стабилизируемые стэкинг-взаимодействием.

Следуетотметить, что коралин склонен к образованию агрегационных структур в водныхрастворах.Бензофенантридиновыйпротоберберины,алкалоидобладаетсангвинаринпротивомикробной,(рис.1.14),какпротивовируснойиипротивоопухолевой активностью [96-100].Рис.1.14. Структура сангвинарина.Исследование взаимодействия сангвинарина с ДНК проводилось сиспользованиемметодовфлуоресценции,спектрофотометрии,круговогодихроизма, калориметрии, ЯМР-спектроскопии. Наличие гипохромного эффектаи батохромного сдвига на спектрах поглощения при титровании, раскручиваниеплазмидной ДНК, а также данные, полученные из ЯМР-спектроскопии позволилиавторам сделать вывод об интеркаляции лиганда в двойную спираль ДНК [101-28104].Процесссвязываниясангвинаринасмакромолекулойявляетсяэкзотермическим и преимущественно энтропийным [105].Значительно меньше известно о способности связывания с ДНК алкалоидов,обладающихменеепротяженнойгетероциклическойсистемой,чемрассмотренные выше.

К подобным соединениям можно отнести группуфлавоноидов, производных бензо-γ-пирона (рис.1.15).Эти соединения также обладают широким спектром воздействия наорганизм: антиоксидантным, противоаллергическим, противовоспалительным,противомикробным,противовируснымипротивоопухолевым[106,107].Последнее обстоятельство инициировало исследование взаимодействия с ДНКтрех флавоноидов: морина, рутина и кверцетина [108]. Cпектрофотометрическимметодом было показано наличие их взаимодействия с макромолекулой.

Все трисоединенияпроявляютсхожееспектральноеповедениеприувеличенииконцентрации ДНК в растворе, которое объясняется авторами интеркаляциейлигандов в двойную спираль молекулы ДНК.Рис.1.15. Структура флавоноидов: морин (а), рутин (б), кверцетин (в) [108].Таким образом, можно сделать вывод, что синтетические алкалоиды,обладающиеплоскимхромофоромипроявляющиепротивоопухолевуюактивность, способны взаимодействовать с молекулой ДНК различным образом взависимости от природы заместителей, последовательности ДНК и условийсреды.

И для определения способа связывания лигандов с ДНК необходимоиспользовать сочетание нескольких методов исследования.29В настоящей работе мы исследовали возможность взаимодействия с ДНКсинтетических алкалоидов двух групп, различающихся размером плоскогогетероциклического хромофора: изохинолины и бензоимидазофталазины.Дляполучениятермодинамическихпараметроввзаимодействияиструктурных характеристик образующихся комплексов использовали методыспектрофотометрии, спектрополяриметрии, микрокалориметрии, вискозиметрии идинамического двойного лучепреломления. 30 2. Методы исследования2.1. Спектроскопия поглощения в видимой и ближней УФ-областиСпектроскопия поглощения в УФ и видимой области распространенныйметод исследования как стабильности ДНК, так и ее взаимодействия с лигандами.Изучение взаимодействий соединений с ДНК может осуществляться посредствомнаблюдения за изменениями в спектрах поглощения.

Как правило, молекулы,используемые в качестве лигандов, имеют полосы поглощения в видимойобласти, то есть неперекрывающиеся с полосой поглощения макромолекулы.Простой способ определения наличия взаимодействие между ДНК и лигандами –наблюдение за положением максимума поглощения свободного лиганда исвязанного с ДНК. Величина смещения в длинноволновую область можетсвидетельствовать о силе взаимодействия [109-113]. Образование комплекса лиганда с молекулой ДНК приводит к изменениям вспектрах поглощения лиганда.

Так как это взаимодействие чаще всего связано собратимым процессом, определение константы связывания помогает понятьприроду и силу данного процесса. Анализ изменения спектров также даетпредставление о стехиометрии образовавшихся комплексов, количественноевыражение которой – количество мест связывание или размер места связывания.В настоящей работе метод спектрофотометрического титрования использовалсядляполученияравновесныхпараметроввзаимодействияисследованныхсоединений с ДНК.Простейшая схема равновесного процесса взаимодействия двух соединенийH и L с образованием комплекса HL выглядит следующим образом:H  L  HL ,(2.1)где H – свободная макромолекула, L – свободный лиганд, HL – комплексмакромолекула-лиганд.Константа связывания:K св HL ,H L(2.2)31где [H] – концентрация свободной макромолекула, [L] – концентрация свободноголиганда, [HL] – концентрация комплекса макромолекула-лиганд.График зависимости r/[L] от r называется изотермой Скэтчарда [114]:r  K  (n  r ) ,[L] св(2.3)где n – количество мест связывания, приходящееся на пару оснований, [L] –концентрация свободного лиганда, r – отношение концентрации связанноголиганда к концентрации макромолекул.Изотерма Скэтчарда служит для определения константы связывания и числамест связывания, так как в случае идентичных и независимых центров связываниязависимость является линейной.

Наклон графика соответствует величине Ксв, наоси ординат отсекается отрезок, равный nКсв, а на оси абсцисс - n.Но в большинстве случаев изотермы Скэтчарда оказываются нелинейными.Это объясняется тем, что, во-первых, могут существовать центры связыванияразличных типов, во-вторых, возможно взаимодействие между связаннымимолекулами лиганда (антикооперативное и кооперативное взаимодействие).На вид изотерм Скэтчарда могут повлиять статистические эффекты,возникающие в том случае, когда молекула лиганда занимает несколько местсвязывания(«исключениесоседнихместсвязывания»).Теоретическоерассмотрение этой ситуации дает уравнение [115] (модель МакГи и фонХиппеля):l 1 1l r  ,r k  1l r   [ L]1 l 1r (2.4)где k – константа связывания изолированного места связывания, l – кажущаясявеличина места связывания.В этом случае:r,r  0 [ L]k  lim(2.5)Для экспериментального определения константы связывания и количествамест связывания следует построить изотерму Скэтчарда, для чего необходимо32найти долю связанного или свободного лиганда.

Для определения долисвязанного лиганда при данной полной концентрации лиганда в растворе [L0]можно использовать любой физический метод, регистрирующий молекулярныйпараметр лиганда, изменяющийся в зависимости от того, в каком состояниинаходится молекула лиганда: свободном или связанном.  Количественный анализ в УФ спектроскопии.В результате поглощения и рассеяния, при прохождении света через среду,его интенсивность падает. Согласно закону Бугера-Ламберта-Бера:I  I 0 10 Cl  I 0 10 D ,(2.6)где I0 – интенсивность падающего света, I – интенсивность света, прошедшегочерез раствор,  – молярный коэффициент экстинкции при толщине слоя раствора1см и концентрации раствора C = 1 моль/л, C – концентрация вещества в растворев моль/л, l – толщина слоя раствора, D – оптическая плотность.Таким образом, для оптической плотности D получаем выражение:D   C l ,Коэффициент экстинкции (2.7)является постоянной величиной для данноговещества при данной длине волны.

Размерность  – М-1см-1. Таким образом,концентрацию вещества можно определить с помощью закона Бугера-ЛамбертаБэра, зная коэффициент экстинкции, толщину кюветы и величину оптическойплотности.На измерении электронных спектров поглощения лиганда и его комплексовс макромолекулой основан метод спектрофотометрического титрования. Этотметод удобен в том случае, если существует область, в которой электронныеспектры поглощения лиганда и макромолекулы не перекрываются.Спектрофотометрическое титрование (СФТ)В основе метода лежит явление избирательного поглощения световогоизлучения растворами различных соединений. Если в растворе одновременноприсутствуют несколько невзаимодействующих светопоглощающих компонент,то общая оптическая плотность раствора будет равна сумме оптическихплотностейкомпонент.Этотпринциписпользуетсядляопределения33концентраций связанного и свободного лиганда.