Диссертация (Взаимодействие молекулы ДНК с синтетическими аналогами антибиотиков и алкалоидов различной структуры), страница 10

Термодинамические параметры взаимодействия соединения 6с ДНК.Метод ΔH, ккал/моль K ,105 M-1nСФТ-3.7±0.30.38±0.03ИКТ-3±11.0±0.50.14±0.0560Соединение 7. В случае соединения 7 наблюдается точка пересечениякривых титрования при С7/CДНК ˂ 0.4, а общая точка пересечения со спектромсвободного лиганда отсутствует (рис.3.7). Можно предположить, что в даннойобласти соотношения концентраций практически нет свободного лиганда иС7/CДНК = r. При этом связанный лиганд находится в двух, спектральноразличимых формах.

При С7/CДНК > 0.4 увеличение содержания лиганда вкомплексе сопровождается появлением свободного лиганда в растворе. В этомслучае термодинамические параметры связывания не могут быть определеныметодом СФТ.СДНК=00,240,220,20(0.08)0,18(0.18)(0.21)(0.37)(0.47)(0.71)(1.13)(1.66)(3.23)(6.36)0,16D0,140,120,100,080,060,040,020,00340360380400420440460480нмРис.

3.7. Спектры поглощения при титровании соед.7 при постояннойконцентрации лиганда, равной 4.3·10-5М, 0≤Сднк≤5.4·10-4М, µ=0.001, цифры вскобках соответствуют значению Слиг/СДНК.Эксперимент по калориметрическому титрованию ДНК соединением 7представлен на рис. 3.8.61Рис. 3.8. Термограмма титрования ДНК соединением 7 при Слиг=4·10-4М,Сднк=1·10-4М, µ=0.001.Результаты ИКТ соединения 8 представлены на рис. 3.9. В отличие отсоединения 7 изменение удельной теплоты при увеличении соотношения С7/CДНКносит немонотонный характер, свидетельствуя о двух процессах, вызывающихQ/кол-во в-ва, ккал/мольизменение тепловых эффектов.0-2-40,00,20,40,60,81,0Cлиг/CДНКРис. 3.9. Калориметрическая изотерма связывания соединения 7 с ДНК:зависимость удельной теплоты, выделившейся при каждой инъекции соединения,от отношения Слиг/CДНК, сплошная линия – обработка по модели с двумянезависимыми типами связывания.62На начальных этапах титрования тепловые эффекты близки к нулю.Максимальное выделение тепла наблюдается при соотношении концентрацийреагентов, С7/CДНК=0.4.

Уменьшение тепловых эффектов при С7/CДНК > 0.4согласуется с данными СФТ о появлении в этих условиях свободного лиганда всистеме. Предположение об отсутствии свободного лиганда при С7/CДНК ˂ 0.4,сделанное на основе данных СФТ, позволяет использовать для качественнойинтерпретации этого участка термограммы безмодельный подход.

Можнопредположить, что связывание лиганда происходит двумя способами: первичным,более энергетически сильным, с энтальпией связывания, близкой к нулю, ивторичным, энтальпию которого можно оценить по максимальной величинеудельной теплоты, достигаемой в этом интервале соотношения концентраций,ΔH2=(-5.6±0.2) ккал/моль. Возрастание энтальпии при увеличении количествасвязанного лиганда может быть вызвано также появлением взаимодействиямежду молекулами лиганда, располагающимися на соседних местах связывания.При аппроксимации моделью с двумя независимыми типами (рис. 3.9) местсвязывания, заложенной в программу микрокалориметра, получаем следующиепараметры связывания:K1= 6·106М-1K2=2.5·105М-1n1=0.29n2=0.72H1=0.09 ккал/мольH2= -6 ккал/мольS1=31.4 кал/моль·KS2=4.3 кал/моль·KРассчитанные при использовании данной модели величины энтальпиисвязывания лиганда обоими способами согласуются с оценкой, полученнойбезмодельным способом.Соединение 8.

Кривые СФТ соединения 8 распадаются на две группыспектров, каждая из которых имеет свою точку пересечения (рис. 3.10). Как и в63случае соединения 8, наличие общей точки пересечения у спектров, в числокоторых не входит спектр свободного лиганда свидетельствует о том, что в этойобласти С8/CДНК свободный лиганд практически отсутствует, а связанныйнаходится в одной из двух спектрально различимых форм. Спектры этой группысоответствуют условию С8/CДНК ˂ 2.

Следовательно, в этом диапазонеконцентраций можно считать С8/CДНК = r. В отличие от соединения 7, в областиизбытка лиганда в системе (С8/CДНК > 2) существует общая точка пересечениякривых титрования со спектром поглощения свободного лиганда.

Это указываетна то, что появление свободного лиганда в системе возникает только при полномнасыщении макромолекулы лигандом. При r ˂ 0.1 (рис.3.10) спектр поглощениялиганда остается постоянным (предельный спектр), характеризуя наиболее сильносвязанную форму лиганда. Описанное выше спектральное поведение соединения8 при взаимодействии с ДНК свидетельствует о его высоком сродстве к ДНК вданных условиях (K>107M-1).0,40СДНК=00,35(0.09)(0.18)(0.25)(0.33)(0.45)0,30D0,250,20(0.61)(0.82)(1.13)0,150,10(2.51)(4.62)0,05(9.13)0,00340360380400420440460480нмРис. 3.10. Спектры поглощения при титровании соед.8 при постояннойконцентрации лиганда, равной 4.2·10-5М, 0≤Сднк≤4.6·10-4М, µ=0.001, цифры вскобках соответствуют значению Слиг/СДНК.Эксперимент по калориметрическому титрованию раствора ДНК растворомлиганда представлен на рис.

3.11.64Рис. 3.11. Термограмма титрования ДНК соединением 8 при Слиг=4·10-4М,Сднк=2·10-4М, µ=0.001.При взаимодействии ДНК с соединением 8 наблюдаются наибольшиетепловые эффекты. Как и в случае соединения 7, вид термограммы, полученной вширокой области изменения соотношения концентраций лиганд/ДНК (рис. 3.12),свидетельствует о более, чем двух способах связывания лиганда.Q/кол-во в-ва, ккал/моль0-2-4-6-8-100,00,51,01,52,0Cлиг/CДНКРис. 3.12. Калориметрическая изотерма связывания соединения 8 с ДНК:зависимость удельной теплоты, выделившейся при каждой инъекции соединения,от отношения Слиг/CДНК, прямая линия соответствует модели с независимымиместами связывания.65Отсутствие свободного лиганда по данным СФТ позволяет использоватьбезмодельный подход для расчета энтальпии взаимодействия двух типовсвязывания, существующих в области С8/СДНК ˂ 1. Для более точного определенияэнтальпии первичного связывания соединения 8 с ДНК было проведено ИКТ вусловиях большого избытка концентрации ДНК (С8/СДНК ˂ 0.1) (рис.

3.13). В этихусловиях, согласно СФТ, имеет место только первичный способ связывания, иотсутствует свободный лиганд. Исходная СДНК = 2·10-4М. Исходная концентрациялиганда (Слиг = 1.3·10-4М) исключала его димеризацию в растворе. Величинатеплоты, ΔQ, выделяющейся при каждой инъекции лиганда, в этих условиях былапостоянной, свидетельствуя об одном способе связывания, энтальпия которогоΔH1 = (-4.4±0.2) ккал/моль. Тогда, согласно рис. 3.12, энтальпия вторичногосвязывания ΔH2 = (-9.6±0.2) ккал/моль.0Q/кол-во в-ва, ккал/моль-1-2-3-4-5-6-7-8-9-100,000,020,040,060,080,100,12Слиг/СДНКРис. 3.13. Калориметрическая изотерма связывания соединения 8 с ДНК:зависимость удельной теплоты, выделившейся при каждой инъекции соединения,от отношения Слиг/CДНК.При аппроксимации участка титрования в области С8/СДНК ˂ 1.5 моделью сдвумя независимыми типами (рис.

3.12) мест связывания, заложенной впрограмму микрокалориметра, получаем следующие параметры связывания:K1= 1.3·108М-1K2=1.3·106М-166n1=0.36n2=1.07H1=-1.5 ккал/мольH2=-9.6 ккал/мольS1=35.3 кал/моль·KS2=4.5 кал/моль·KКак и в случае соединения 7, рассчитанные по данной модели величиныколичественно согласуются с безмодельным расчетом.Третий тип связывания при С8/СДНК > 1 возникает при значительномизбытке лиганда и вероятно носит агрегационный характер.

Оценку егопараметров не проводили.Первичное связывание c ДНК соединений 7 и 8, как и связываниесоединения 6 с ДНК, обладает значительно более низкой энтальпией, чемвторичное связывание соединений 7 и 8. Свободная энергия взаимодействия сДНКсоединения(ΔG)6поданнымИКТ,составляет-6.7 ккал/моль.Следовательно, энтропийный вклад в свободную энергию образования комплексаДНК-6, TΔS=+3.7 ккал/моль. Величина энтальпии первичного взаимодействиясоединения 8 близка к значению энтальпии взаимодействия соединения 6.

Вслучае соединения 7 первичное связывание с ДНК имеет исключительноэнтропийный характер. Можно предположить, что первичное связывание этихсоединений с ДНК является мономерным. В случае соединения 7 и особенносоединения 8 увеличение содержания лиганда в комплексе приводит квзаимодействию связанных молекул лиганда между собой, а в случаесоединения 8 и к образованию связанных димеров, вызывая значительноеповышение энтальпии вторичного связывания.Вискозиметрия и динамическое двойное лучепреломление.

Для определенияспособа связывания лигандов с ДНК в области первичного связывания (r ˂0.2)использовалиметодыхарактеристическойвискозиметриивязкостиииотношенияДЛП.РезультатыПетерлинаизмеренияпредставленыв67таблицах 3.2 и 3.3.Таблица 3.2. Гидродинамические и оптические характеристики растворовДНК и ее комплексов с индольными производными изохинолина.rΔn/g·10-7, сCДНК,% ηr,Комплексм·с2/кгДНК0.00351.53±0.0514±126 ± 2ДНК – 6 соед.

0.1 0.00301.68±0.0517±125 ± 2ДНК –7 соед. 0.2 0.00351.58±0.0515±125 ± 2ДНК – 8 соед. 0.2 0.00351.75±0.0520±127 ± 2Таблица 3.3. Характеристическая вязкость и изменение контурной длинымакромолекулы в составе ее комплексов с индольными производнымиизохинолина.r[η], м3/кг(Lr/LДНК)эксп (Lr/LДНК)теор. интерк.КомплексДНК015 ± 1--ДНК – 60.118 ± 11.13±0.031.1ДНК - 70.2 15.0 ± 1.51.00±0.051.2ДНК - 80.2 21.0 ± 1.51.25±0.051.2Увеличение характеристической вязкости наблюдается при образованиикомплекса ДНК с соединениями 6 и 8.

Величина соотношения Петерлина,пропорциональная термодинамической жесткости макромолекулы, остается впределах погрешности постоянной (таблица 3.2).Следовательно,увеличениехарактеристическойвязкостиДНКприкомплексообразовании с соединениями 6 и 8 происходит в результате измененияееконтурнойдлины.Используяформулу(2.29),принеизменной68термодинамической жесткости получаем:,(3.1)Расчет показывает (таблица 3.3), что это изменение соответствуетожидаемому при интеркаляции связавшихся молекул лиганда в двойную спиральДНК. Соединение 7 связывается снаружи двойной спирали ДНК, не изменяя еемакромолекулярные параметры.ВыводыЗависимость способа связывания соединений от их структуры.соединениявусловияхэкспериментаимеютположительныйзарядВсенаизохинолиновом хромофоре.

Поэтому большую роль в их взаимодействии с ДНКиграют электростатические взаимодействия. По своей структуре все триисследованных соединения различаются только положением метильной группы.В случае соединения 6 она располагается на изохинолиновом кольце молекулы. Вслучае соединения 7 эта группа находится на индольной части молекулы.Соединение 8 метильной группы не имеет.