Диссертация (Взаимодействие молекулы ДНК с синтетическими аналогами антибиотиков и алкалоидов различной структуры)

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТКафедра молекулярной биофизики и физики полимеровНа правах рукописиОсинникова Дарья НиколаевнаВзаимодействие молекулы ДНК с синтетическими аналогами антибиотикови алкалоидов различной структуры02.00.06 – высокомолекулярные соединенияДиссертация на соискание ученой степеникандидата физико-математических наукНаучный руководитель:к.ф.-м.н., доцент Морошкина Е. Б.Санкт-Петербург20161СодержаниеВведение ...........................................................................................................................

21. Взаимодействие молекулы ДНК с низкомолекулярными соединениями............. 81.1. Различные способы связывания низкомолекулярных биологическиактивных соединений с двойной спиралью ДНК ..................................................... 81.1.1. Интеркаляционное связывание ..................................................................... 81.1.2. Бороздочное связывание .............................................................................. 121.1.3. Внешнее связывание .....................................................................................

151.1.4. Сложные комбинированные взаимодействия ............................................ 161.2. Алкалоиды ........................................................................................................... 232. Методы исследования ............................................................................................... 302.1. Спектроскопия поглощения в видимой и ближней УФ-области ................... 302.2. Метод кругового дихроизма ..............................................................................

342.3. Изотермическая калориметрия .......................................................................... 382.4. Вискозиметрия как метод исследования изменений макромолекулярныхпараметров ДНК при комплексообразовании .........................................................

412.5. Двойное лучепреломление в потоке ................................................................. 452.6. Приготовление растворов комплексов ДНК-лиганд и особенности ихгидродинамического поведения ............................................................................... 503. Производные изохинолина .......................................................................................

563.1. Индольные производные изохинолина............................................................. 56Выводы ........................................................................................................................ 683.2. Пирроло-изохинолины ....................................................................................... 69Выводы ........................................................................................................................ 804. Бензоимидазофталазины .......................................................................................... 81Выводы ........................................................................................................................ 98Заключение ..................................................................................................................

100Список литературы ..................................................................................................... 1042ВведениеМолекула ДНК, дезоксирибонуклеиновая кислота, ответственна за хранениеи передачу наследственной информации всех живых организмов. Она содержит всебе всю информацию от цвета глаз до генетических заболеваний. Поэтомувозможность воздействия на молекулу ДНК открывает широкие возможности влечении болезней.Молекула ДНК является мишенью для воздействия многих биологическиактивных веществ (БАВ), которые, в свою очередь, делятся на природные исинтетические. Функции БАВ разнообразны: участие в обменных процессах,катализ химических реакций.

Некоторые БАВ способны подавлять ростзлокачественных опухолей. Все это объясняет огромный интерес к синтезу новых,более эффективных препаратов, способных взаимодействовать с ДНК.Взаимодействие БАВ с ДНК обусловлено структурой макромолекулы.Первичнаяструктурафосфодиэфирными–последовательностьсвязями.Каждыйизнуклеотидов,соединенныхнуклеотидовсостоитизгетероциклического азотистого основания, остатка дезоксирибозы и фосфатнойгруппы.

ДНК содержит два типа азотистых оснований: пуриновые – аденин игуанин, пиримидиновые – цитозин и тимин. Молекула ДНК является сильнымполиэлектролитом, благодаря остатку фосфорной кислоты, входящему в составкаждого нуклеотида.Модель вторичной структуры молекулы ДНК была предложена Уотсоном иКриком [1,2] в 1953 году. Согласно этой модели, молекула ДНК состоит из двухантипараллельных полинуклеотидных цепей, связанных водородными связями,возникающими между основаниями этих цепей.

Аденин связывается с тиминомдвумяводороднымисвязями,агуанинсцитозином–тремя.Такаяизбирательность при взаимодействии называется правилом комплементарности.Внутри спирали пуриновые и пиримидиновые основания образуют«стопку», их плоскости перпендикулярны оси спирали и параллельны друг другу.Между основаниями в этой стопке возникают гидрофобные взаимодействия,3вносящие основной вклад в стабилизацию двойной спирали, больший, чемводородные связи между цепями.Результаты рентгеноструктурного анализа показывают [3-5], что могутсуществоватьразличныевидыдвойныхспиралей,которыеотличаютсягеометрическими параметрами. Наиболее часто встречающаяся в природе Вформа спирали ДНК.

Она устойчива при высокой влажности (97%), диаметрспирали 20 Å, высота витка вдоль оси спирали – 36 Å (на один виток приходится10 пар оснований). На поверхности В – формы спирали образуются две бороздки:большая - шириной ~ 22 Å, и малая -12 Å, глубина обеих канавок – 7 Å.Плоскости азотистых оснований почти перпендикулярны оси спирали, котораяпроходит вблизи центра тяжести пар, так что внутренность спирали заполнена [6].ДНК – довольно жесткая структура, но, несмотря на это, она обладаетконформационной подвижностью. В результате теплового движения, поддействием внешних условий и при взаимодействии с различными соединениями(лигандами) могут происходить локальные изменения параметров двойнойспирали (раскручивание, изломы, изгибы, расхождение пар оснований). В связи сэтим, способы взаимодействия лигандов с макромолекулой могут быть различны:интеркаляция, бороздочное связывание, электростатические взаимодействия сфосфатными группами на поверхности двойной спирали.В зависимости от способа связывания, многие лиганды могут нарушатьфункции макромолекулы, в результате чего, например, тормозится ростзлокачественных новообразований.

Это делает весьма актуальным проводимое вданной работе исследование новых синтетических соединений, синтезированныхна основе уже известных лекарственных агентов.К биологически активным соединениям относятся антибиотики (продуктыжизнедеятельности бактерий) и алкалоиды (органические азотсодержащиесоединения, преимущественно растительного происхождения). Механизмы ихвоздействия на организм весьма разнообразны, от обезболивающего действия допротивоопухолевой активности. Так, известный антибиотик, актиномицин D4используетсявтерапиипротиврака[7],аалкалоидпапаверинкакспазмолитическое средство [8].С целью повышения эффективности и уменьшения побочных действий,постоянно идет синтез новых соединений, аналогов уже известных лекарственныхсредств.Известно, что некоторые лиганды, обладая плоским гетероциклическимхромофором, способны встраиваться между парами оснований двойной спиралиДНК, тем самым нарушая ее функционирование в качестве матрицы.

Однако донастоящего времени не существует однозначных выводов о зависимости способасвязывания гетероциклических лигандов с ДНК от их химической структуры.Целью работы являлось исследование взаимодействия с молекулой ДНК24 новых синтетических соединений, составляющих две группы аналоговалкалоидов изохинолинового и фталазинового рядов: определение условийобразования обратимых равновесных комплексов данных соединений с ДНК изависимости способа связывания с макромолекулой от особенностей ихструктуры.Для достижения цели, были поставлены следующие задачи: определениетермодинамическихпараметровсвязыванияновыхсинтетических лигандов с ДНК, определениеизменениймакромолекулярныхпараметровДНКприсвязывании с лигандами.Для решения этих задач были использованы микрокалориметрический,спектральные, гидродинамические и оптические методы исследования.Научная новизна работы.

Впервые были получены комплексы новыхсинтетических производных изохинолина и бензоимидазофталазина с молекулойДНК. Были определены термодинамические параметры их взаимодействия, атакже способы связывания этих лигандов с макромолекулой. Впервые былопоказано, что в условиях полуразбавленных растворов высокомолекулярной ДНКпри малых концентрациях лиганда диалкиламиноалкильные производные5актиноцинамогутобразовыватькомплексысмакромолекулойввидемежмолекулярных сшивок.Теоретическаяипрактическаязначимостьработы.Результаты,полученные в настоящей работе, расширяют круг соединений – комплексоновДНК, которые могут быть использованы в процессе направленного поиска новыхлекарственныхпрепаратов.Образованиедиалкиламиноалкильнымипроизводными актиноцина межмолекулярных сшивок ДНК, обнаруженное вработе, может служить новым механизмом биологического действия этихсоединений in vivo.Методология.ДляустановленияналичиявзаимодействияДНКсисследуемыми соединениями и определения термодинамических параметровкомплексообразованиябылипримененыметодыспектрофотометрии,спектрополяриметрии и калориметрии.

Для определения структуры комплексов испособов связывания данных соединений с ДНК применялась методика сиспользованием вискозиметрии и динамического двойного лучепреломления впотоке. Эта методика была ранее разработана и в течение ряда лет испытана наизвестных соединениях, взаимодействующих с ДНК различными способами.Личныйвкладавторазаключаетсявподготовкеипроведенииэкспериментов (кроме экспериментов по калориметрии, которые были выполненыв ресурсном центре СПбГУ «Термогравиметрические и калориметрическиеметодыисследования»),вобработкеполученныхданных,анализеиинтерпретации результатов, подготовке публикаций по теме исследований.Достоверностьвоспроизводимостьюполученныхэкспериментальныхрезультатоврезультатовподтверждаетсяисогласованностьюданных.Апробация работы. Основные результаты, полученные в работе, былипредставлены на следующих конференциях:1.