Диссертация (Взаимодействие молекулы ДНК с синтетическими аналогами антибиотиков и алкалоидов различной структуры), страница 4

Подобныесоединения, обладающие двумя или более центрами связывания с ДНК,встречаются,каксредиразличныхбиологическиактивныхприродныхсоединений, так и среди их многочисленных синтетических аналогов.Синтез таких соединений проводится как с целью увеличения сродствасоединения к ДНК, так и с целью увеличения его специфичности. Примероммогут служить дистакцины, синтезированные в Технологическом институте,являющиеся гибридами интеркалирующего антибиотика актиномицина D испецифично связывающегося по малой бороздке антибиотика дистамицина А. Вработе [50] было показано, что способ связывания таких соединений с ДНКзависитотвеличиныфрагментадистамицина.Присоединениебольшихфрагментов дистамицина, у которых число метилпиррольных колец достигаеттрех, приводит к связыванию соединения в малой бороздке двойной спиралиДНК, подобно дистамицину. Интеркаляции актиноцинового хромофора при этомне происходит.

При меньшем количестве метилпиррольных колец, напротив,имеет место интеркаляция актиноцинового хромофора, но не наблюдаетсясвязывания по малой бороздке. Этот результат показывает, что объединение водной молекуле различных, способных к индивидуальному взаимодействию сДНК групп, не всегда приводит к их одновременному связыванию с ДНК.Такой же вывод может быть сделан и на основе серии работ поисследованию взаимодействия с ДНК соединений, содержащих два или болееинтеркалирующих хромофора [53-55].

В работе [53] было показано, чтоминимальная длина соединительной цепочки между хромофорами, при которойсоединение является бисинтеркалятором, равна 10.1 Å. При меньшей длинелинкера лиганд является моноинтеркалятором [56].В то же время известны синтетические димеры бороздочных лигандов,связывающихся в малой бороздке ДНК с высоким сродством и повышеннойспецифичностью [57-59].20Помимо структуры гибридного лиганда, на способ его связывания с ДНКоказывают влияние условия, при которых происходит образование комплекса.Такприувеличениисодержаниявкомплексесоединенийсдвумяинтеркалирующими хромофорами бис-интеркаляционное связывание переходит вмоно-интеркаляционное [56].Одним из возможных следствий взаимодействия с ДНК бифункциональныхсоединений является образование сшивок.Образование сшивок было предположено при исследовании взаимодействияДНК с актиноцил-бис-битиазолом (рис.1.8) [60].ORRONNH2OOCH3CH3SR=NH(CH2)2NSCONH(CH2)3N(CH3)2NРис.1.8.

Структура актиноцил-бис-битиазола.Способ связывания этого соединения с ДНК зависит от количества лигандав комплексе. При очень малом соотношении концентраций лиганд/ДНК,соединение оказалось бис-интеркалятором. Интеркалирующими элементамиявляются плоские битиазольные остатки, а актиноциновый хромофор в этомслучае играет роль линкера.

При увеличении количества лиганда в комплексевеличина характеристической вязкости кооперативно уменьшается примерно вдвараза.Такоегидродинамическоеповедениекомплексапозволилопредположить одновременное взаимодействие молекулы лиганда с двумяудалёнными по цепи и случайно сблизившимися участками двойной спирали21ДНК, т.е. образование внутримолекулярной сшивки. Образование такой сшивкиможет идти либо за счёт интеркаляции битиазольных участков, либо, что болеевероятно, за счёт электростатических взаимодействий катионных групп лиганда сфосфатными группами ДНК. И в этом случае актиноциновый хромофор невзаимодействует непосредственно с двойной спиралью ДНК.Образование внутримолекулярных сшивок при случайном сближенииотдаленных частей одной цепи ДНК наблюдалось ранее при исследованиивзаимодействия ДНК с некоторыми полимерными молекулами: гистоном Н1 [61]и синтетическими полипептидами, обладающими достаточным количествомположительно заряженных аминокислотных остатков и не имеющих участковцепи с уникальной вторичной структурой [62].При условии сближения различных молекул ДНК в растворе может бытьобразована межмолекулярная сшивка.

Такие сшивки наблюдались в работе [63].В этой работе для создания сшивок использовали антибиотик антрациклиновогоряда дауномицин, который может образовывать плоские полимерные комплексы.При образовании комплекса с ДНК кето-кислород молекулы антибиотикаостается доступным для реакции хелатообразования с другой молекулойдауномицина, что приводит к образованию сшивки между двумя молекуламиДНК.Нековалентные межмолекулярные сшивки были также обнаружены приисследовании с использованием электронной микроскопии взаимодействия сДНК известного цитостатического агента блеомицина [64].Наличие протонированных групп в молекулах интеркалирующих илибороздочныхсоединенийоказываетсущественноевлияниенахарактерсвязывания этих соединений с ДНК и приводит к его зависимости от ионной силысреды (μ).

При μ>0.1 роль катионной природы лиганда не столь существенна, таккак при этих условиях имеется значительная экранировка фосфатных групппротивоионамираствора.Приуменьшенииионнойсилызначительноеувеличение роли электростатического взаимодействия приводит, во-первых, кповышению константы первичного связывания лиганда (интеркаляционного или22бороздочного).Кроменеспецифическоетого,внешнеекпервичномусвязывание,связываниюобусловленноеприсоединяетсянепосредственнымвзаимодействием катионоидных групп лиганда с фосфатными группами ДНКТак, исследования аминопроизводного толуола, толуидинового синего(рис.1.9),обладающегогетероциклическимхромофоромиположительнозаряженной боковой группой, показали, что при малых значениях ионной силы0.05 M лиганд взаимодействует с макромолекулой посредством частичнойинтеркаляции и внешнего связывания.Рис.1.9.

Структура толуидинового синего.При уменьшении электростатических взаимодействий путем увеличенияионной силы среды до 0.3 M интеркаляция оказалась единственным способомсвязывания толуидинового синего с ДНК [65].При исследовании взаимодействия с ДНК ряда диаминоалкильныхпроизводных актиноцина (рис.1.10) с ДНК также было показано, что приуменьшенииионнойактиноциновогообусловленноесилыхромофорасредылигандоввзаимодействиемкинтеркаляционномудобавляетсяпротонированныхгруппировок с фосфатными группами ДНК [13].внешнеесвязываниюсвязывание,диалкиламиноалкильных23Рис.1.10.

Структура диаминоалкильных производных актиноцина [13].Результаты спектральных и гидродинамических исследований полученныхкомплексовпозволилипредложитьмодельвторичногосвязывания,собразованием димеров лиганда, один из мономеров которого интеркалирует вдвойную спираль ДНК, а второй располагается в малой бороздке ДНК.Таким образом, можно сделать вывод, что соединения, имеющие в своемсоставеплоскиймоментомилигетероциклическийпротонированнымихромофор,группамиобладающиемогутдипольнымвзаимодействоватьсмолекулой ДНК, образуя комплексы различной структуры.

Образование такихкомплексов служит молекулярной основой биологической активности многих изподобных соединений. Этим обусловлен интерес к изучению взаимодействия сДНК различных природных алкалоидов и их синтетических аналогов.1.2. АлкалоидыАлкалоиды – органические азотосодержащие соединения, преимущественнорастительного происхождения. К настоящему времени выделено свыше 10000алкалоидов разнообразных структурных типов, что превышает число известныхсоединений любого другого класса природных веществ. Многие алкалоидыпроявляют достаточно сильную биологическую активность. Так, в малых дозахони являются лекарствами, в больших – яды.

К алкалоидам относятся такиевещества, как морфин, кофеин, кокаин, стрихнин, хинин и никотин. По24биологическойактивностипрактическиневозможноклассифицироватьалкалоиды, так как спектр их действия чрезвычайно разнообразен.Одной из наиболее важных сфер применения алкалоидов являетсямедицина. Так, в процессе поиска новых более эффективных лекарственныхпрепаратов, идет постоянный синтез аналогов уже известных алкалоидов. Однимиз разнообразных молекулярных механизмов биологического действия различныхалкалоидов является их способность взаимодействовать с молекулой ДНК.Одним из первых алкалоидов, у которых обнаружилась способностьсвязыватьсясмолекулойДНК,былиндольныйалкалоидэллиптицин,обладающий протяженной плоской гетероциклической структурой (рис.1.11).Рис.1.11. Структура эллиптицина.Эллиптицин был впервые выделен в 1959 году [66].

У него былаобнаружена противоопухолевая активность, что послужило мотивацией длясинтеза таких производных как 9-гидрокси эллиптицин и другие [67-70]Способность связывания эллиптицина с ДНК путем интеркаляции былаобнаружена методом ЯМР [71]. На основании этих данных был сделан вывод омолекулярномзаключаетсямеханизмевегоегопротивоопухолевойспособностиобразовыватьактивностикоторыйтройнойкомплексДНК/топоизомераза/ эллиптицин [72].Наиболее хорошо исследованным производным эллиптицина является 9гидрокси эллиптицин (9-OHE).Наосновеэкспериментовпоядерномумагнитномурезонансу,спектрофотометрии и круговому дихроизму был сделан вывод о способностилиганда связываться с ДНК различными способами: интеркаляционным,бороздочным и внешним, в зависимости от соотношения концентраций ДНК илиганда [73,74].При помощи методов УФ-поглощения, кругового и линейного25дихроизма, светорассеяния было показано [72], что соединение проявляетспецифичностькGCучасткамДНК.Крометого,былообнаруженовзаимодействие лиганд/лиганд в комплексе.Из данных по линейному дихроизму были сделаны выводы, что при маломсодержании в комплексе, 9-OHEсвязывается с интеркаляционным способом сразными последовательностями ДНК.

При этом длинная ось хромофораориентирована перпендикулярно длинной оси соседних пар оснований ДНК:группа 9-OH располагается в малой бороздке, а атом азота пиридина лежит вбольшойбороздке.Приповышенииколичества9-OHEнаблюдаетсянеинтеркаляционное связывание [75].Для повышения растворимости в воде и повышения противоопухолевойактивности 9-ОНЕ был подвергнут структурным изменениям, в результате былополучено его производное Celiptium [75], которое отличается только наличиемметильной группы на атоме азота изохинолинового кольца (положение 2).На основании результатов, полученных из линейного дихроизма, былсделан вывод, о проникающей интеркаляции хромофора в двойную спираль ДНК,при которой заместители в положении 2 располагаются в большой бороздкедвойной спирали, а заместители в положении 9 – в малой.Средимногочисленныхрастительныхалкалоидов,наиболеераспространенными являются соединения, содержащие изохинолиновое ядро.Протяженную плоскую гетероциклическую структуру этого класса алкалоидовимеют бензилизохинолины, бензофенантридины, и протоберберины [76].Протобербериновые алкалоиды имеют широкий спектр биологическойактивности, которая включают ингибирование синтеза ДНК, биосинтеза белка,ингибирование мембранной проницаемости.Наиболее известным представителем этой группы алкалоидов являетсяберберин (рис.1.12).Это соединение проявляет разнообразную биологическую активность:антибактериальную [77,78], антивирусную [79,80], антидиабетическую [81,82].Особенный интерес к берберину и другим алкалоидам этой группы возник26благодаря обнаруженной у них противоопухолевой активности [83,84], механизмкоторой связан с ингибированием ДНК-топоизомеразы I и II [83].Взаимодействие берберина с ДНК изучалось с использованием различныхметодов.Наличиегипохромногоэффектаибатохромногосдвигаприспектрофотометрическом титровании [85], наличие низкоинтенсивной полосыИКД [85], а также обнаружение явлений удлинения обработанной ультразвукомкороткой ДНК и раскручивания кольцевой ДНК [86] при их взаимодействии сберберином позволило сделать вывод о его связывании путем частичнойинтеркаляции в двойную спираль ДНК [81,82,87-89].