Диссертация (Изучение роли последовательностей, богатых аспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 9

Программа ZipperDb (Goldschmidt et al., 2010) использует методтрехмерного профиля. В качестве основы используется экспериментальнополученная структура гексапептида, входящего в состав прионного доменаSup35. Для всех возможных гексапептидов было рассчитано, на сколькоэнергетически выгодно им принимать такую же конформацию. ПрограммаArchCandy (Ahmed et al., 2015) основана на учете теоретических ограничений,накладываемых на последовательность. Чтобы образовать амилоиднуюфибриллу, полипептидная цепь должна сформировать несколько β-цепей,образующих так называемые β-арки. ArchCandy находит участки белков,которые могут сформировать β-арки, и, исходя из этого, оцениваетамилоидные свойства белка (Ahmed et al., 2015).Еще один перспективный класс методов биоинформатического поискаамилоидов основан на машинном обучении.

Их отличием является то, что в46ходе обучения программа сама определяет свойства, необходимые дляправильной оценки амилоидогенности белка. К методам, основанных намашинном обучении, можно отнести метод, использованный в работе Албертис соавторами (Alberti et al., 2009), и более сложный метод, основанный нанейронных сетях (Família et al., 2015).За последнее десятилетие было разработано много разнообразныхметодов для предсказания амилоидогенных свойств белков. Они различаютсяпо использованным подходам и точности предсказания. Общим недостаткомимеющихся методов является то, что они способны находить тольковероятныхкандидатов,изачастуюдаютмноголожнопозитивныхпредсказаний (по: Cascarina and Ross, 2014).

Это объясняется относительнонебольшим количеством известных амилоидов и еще меньшим количествомизвестных моделей структуры амилоидов.3.6.2 Биохимические методыОднойизважнейшихзадачвизученииамилоидовявляетсяидентификация амилоидных белков. В связи с этим было разработано многоразличных экспериментальных методов, решавших эту задачу.Большинство биохимических методов состоят из двух независимыхэтапов: выделения фракции амилоидов и идентификации входящих в ее составбелков.

К методам собственно идентификации относят секвенирование белков(Benditt et al., 1971; Glenner et al., 1971) (в настоящее время почти неиспользуется) и масс-спектрометрия (Kryndushkin et al., 2013; Nizhnikov et al.,2014).Единственным универсальным свойством амилоидов является ихвысокая устойчивость к обработке детергентами таким как додецилсульфатомнатрия (SDS) или лаурилсаркозинатом натрия (Kryndushkin et al., 2003; Mitsuiet al., 2006; Peretz et al., 2006). В лаборатории М.Д. Тер-Аванесяна былопоказано, что фракцию обогащённую амилоидными полимерами можно47выделить из дрожжей, обработав клеточный лизат 1%SDS, и осадив детергентустойчивые агрегаты ультрацентрифугированием (Kushnirov et al., 2006).

Этотметод позволял детектировать Sup35NM при сверхпродукции в лизате изштаммов [PSI+], но не подходил для детекции белков с меньшим уровнемпродукции. Позже был предложен более чувствительный метод TAPI(Technique for Amyloid Purification and Identification – методика выделения иидентификацииамилоидов),такжеоснованныйнанерастворимостиамилоидов в присутствии SDS (Kryndushkin et al., 2013). Очистка амилоидовосуществлялась за счет того, что амилоидные фибриллы не входили вполиакриламидный гель. Их идентификация осуществлялась при помощимасс-спектрометрии. Не смотря на высокую чувствительность метода, TAPIдаёт плохо воспроизводимые результаты (Kryndushkin et al., 2013).На устойчивости амилоидов к обработке детергентами основан и методпротеомного скрининга и идентификации белков PSIA (Proteomic Screeningand Identification of Amyloids) (Nizhnikov et al., 2014).

Фракция детергентустойчивыхагрегатов,обогащеннаяпотенциальнымиамилоидами,выделяется серией ультрацентрифугирований и обработкой детергентами.Полученнаясмесьодномерногоилибелковдополнительнодвумерногоразделяетсяэлектрофореза,иприотдельныепомощибелкиидентифицируют с помощью масс-спектрометрии. Этот метод, как и TAPIимеет определённые ограничения. Некоторые амилоиды могут бытьустойчивы только к одному детергенту и не устойчивы к другому. В то жевремя некоторые неамилоидные белковые комплексы могут быть устойчивы кобработке детергентами (к примеру, к лаурилсаркозинату натрия).

Еще однимограничением является то, что некоторые амилоиды плохо растворимы вбуфере, используемом для двумерного электрофореза. Также они могутобладать слишком высокой или низкой изоэлектрической точкой, что непозволяет детектировать двумерным электрофорезом (Nizhnikov et al., 2014).Существует модификация метода, когда вся смесь белков из фракциидетергент-устойчивых агрегатов подвергается обработке трипсином, а затем48смесь пептидов разделяется при помощи высокоэффективной жидкостнойхроматографии и идентифицируется масс-спектрометрией (PSIA-HPLCMALDI) (Antonets et al., 2016).

Последний вариант метода позволяетидентифицировать наибольшее количество белков и обладает хорошейвоспроизводимостью.3.7 ЗаключениеВ ходе исследований амилоидов был достигнут значительный прогрессв методах идентификации амилоидных белков. Хотя протеомные методыпозволяют идентифицировать только кандидатов на роль амилоидных белков,онидаютвозможностьпроводитьскринингсредивсехбелков,продуцируемых организмом.Появление новых методов сделало возможным не просто выявлениеновых амилоидов, но изучение влияния амилоидов на амилоидогенез другихбелков.

В частности, метод PSIA позволяет идентифицировать белки, которыеформируют детергент-устойчивые агрегаты в присутствии тех или иныхамилоидов (Nizhnikov et al., 2014). Это было показано в лаборатории М.Д. ТерАванесяна, где идентифицировали ряд дрожжевых белков, которыеполимеризуются на фоне агрегации полиглутаминового домена хантингтина.Оказалось, что непрерывный протяжённый полиглутаминовый тракт являетсяэффективнойматрицей,вызывающейагрегациюрядадругихQN-обогащённых белков.

Вместе с тем, мутантный Хангтингтин скореепредставляет собой исключение из правил – большинство амилоидогенныхбелков содержат несколько относительно коротких последовательностей,склонных к агрегации, в которых чередуются разные аминокислотныеостатки. Известно, что расположение амилоидогенных трактов определяетвозможность кросс-индукции амилоидогенеза (Toombs et al., 2011), однаковопрос о влиянии аминокислотного состава на взаимодействие агрегирующихбелков остаётся неизученым. В этой работе с помощью комплекса49генетических, биоинформатических и протеомных методов мы оцениваемвлияние аминокислотного состава прион-формирующих последовательностейнаамилоидныесвойстваисследуемыхамилоидогенеза.50белковикросс-индукцию4 Материалы и методы4.1 Штаммы микроорганизмов, среды и условия культивированияВ работе использовали штамм бактерии Escherichia coli DH5α,следующего генотипа: supE44 ΔlacU169 (φ80lacZΔM15) hsdR17 recA1 endA1gyrA96 thi-1 elA1 (Hanahan and D, 1985).

Для культивирования бактерий E. coliиспользовали жидкую и твердую среды LB (Sambrook et al., 1989). Штаммыбактерийкультивировалипритемпературе37ºС.Бактериальныхтрансформантов, устойчивых к ампициллину, отбирали на среде LB сампициллином в концентрации 50мкг/мл.Штаммы дрожжей S. cerevisiae, использованные в работе, приведены вТаблица 2.При работе со штаммами дрожжей использовали стандартныедрожжевые среды: органическую среду YАPD, а также жидкие и твердыеминимальные среды MD. В минимальные среды добавляли витамины имикроэлементы, а также необходимые азотистые основания и аминокислоты.Для сверхэкспрессии генов, находящихся под контролем индуцибельногопромотора гена CUP1, в среду MD добавляли CuSO4 производства«РЕАХИМ» (РФ) в концентрации 150 мкМ.

Для проверки способностиштаммов терять фенотип Ade+ на среде с хлоридом гуанидина использовалимодифицированную среду: YAPD с добавлением 5 мМ хлорида гуанидинапроизводствакомпании“QIAGEN”(США).культивировали при температуре 30ºС.51ДрожжевыештаммыТаблица 2. Штаммы дрожжей, использованные в работеШтаммГенотип, прионные детерминантыСсылкаOT56MATa ade1-14UGA his3 leu2 trp1-289UAG(Derkatch et al.,ura3 [PSI+][PIN+]1996)MATa ade1-14UGA his3 leu2 trp1-289UAG(Matveenkoura3 [psi-][PIN+]al., 2016)MATa ade1-14UGA his3 leu2 trp1-289UAG(Matveenkoura3 [psi-][pin-]al., 2016)9-10-7A-MATα ade1-14UGA his7-1 leu2 lys2 trp1(БондаревD832ura3др., 2017)1-OT562-OT56SUP35::TRP1RNQ1::KanMXetetи[pYCM-U2- SUP35] [PSI+][pin-]2-D-701MATα ade1-14UGA trp1 leu2 ura3 lys2Получен[PSI+][pin-]настоящейвработеGT159GT174MATa ade1-14UGA his3 trp1Δ leu2 ura3(Chernoff et al.,lys2 [psi-][PIN+]1999)MATa ade1-14UGA his3 trp1Δ leu2 ura3(Chernoff et al.,lys2 [psi-][ pin-]1999)Примечание.

Генотипы штаммов дрожжей охарактеризованы в соответствии состандартной трехбуквенной номенклатурой (Захаров и др., 1984; Sherman et al., 1986).Аллель ade1-14 содержит нонсенс-мутацию UGA; trp1-289 – нонсенс-мутацию UAG; ura352 – инсерцию дрожжевого мобильного элемента Ty1 в кодирующую часть гена URA3; leu23,112 – двойные мутации в гене LEU2.4.2 ПлазмидыВ ходе данной работы был использован ряд плазмид, приведенных вТаблица 3.52Таблица 3. Плазмиды, использованные в ходе работыНазваниеТипpRS316cenПромотор ГенМаркерСсылкаURA3(Sikorski and Hieter,1989)pRS315cenLEU2(Sikorski and Hieter,1989)pCUP1-RNQ1-cenCUP1RNQ1-CFPLEU2Предоставлена С.П.ЗадорскимCFP(LEU2)(СПбГУ)pGPD-PrP-CFPcenGPDPrP(23-LEU2(Rubel et al., 2013)231)-CFPpGPD-YFP(URA3)cenGPDYFPURA3(Rubel et al., 2013)pGPD-CFP(LEU2)cenGPDCFPLEU2(Rubel et al., 2013)pRS316CGcenCUP1GFPURA3(Serio et al., 1999)pmCUPNMsGFP2μCUP1SUP35NM-URA3(Serio et al., 1999)URA3ПолученаGFPpU-CUP1-cenCUP1GLN3QN-YFPpGPD-SUP35NMCFPGLN3QN-настоящей работеYFPcenGPDвSUP35NM-LEU2Полученавнастоящей работеCFPПримечание: cen – центромерная плазмида.

Все плазмиды в таблицесодержат ген устойчивости к ампициллину для селекции в E. coli.53Продолжение Таблицы 3НазваниеТипПромоторpU-CUP1cenCUP1ГенМаркерСсылкаURA3Полученавнастоящей работеpL-CUP1cenCUP1LEU2Полученавнастоящей работеpU-CUP1-YFPcenCUP1YFPURA3Полученавнастоящей работеpL-CUP1-CFPcenCUP1YFPLEU2Полученавнастоящей работеpUCup-cenCUP1SUP35NwtURA3Полученавнастоящей работеSup35NwtpUCup-cenCUP1SUP35NNURA3Полученавнастоящей работеSup35NNpUCup-cenCUP1SUP35NFURA3Полученавнастоящей работеSup35NFpUCup-cenCUP1Sup35Nwt-YFPpUCup-CUP1Sup35NN-YFPCUP1Sup35NF-YFPSUP35NN-URA3CUP1вПолученавнастоящей работеSUP35NF-URA3Полученавнастоящей работеYFPcenПолученанастоящей работеYFPcenpLCup-Mad1-URA3YFPcenpUCup-SUP35Nwt-MAD1-CFPLEU2Полученавнастоящей работеCFPpLMad1-Mad1-cenMAD1MAD1-CFPLEU2Полученавнастоящей работеCFPПримечание: cen – центромерная плазмида.

Все плазмиды в таблицесодержат ген устойчивости к ампициллину для селекции в E. coli.4.2.1 Плазмиды, полученные в данной работеПлазмиды pL-CUP1 и pU-CUP1 (Рисунок 2) были получены из плазмидpRS315 и pRS316 соответственно путем вставки фрагмента SalI-HindIII,54несущего последовательность промотора дрожжевого гена CUP1. Фрагментбыл получен с помощью ПЦР с праймерами Cup1SalIF и Cup1Hind3R(Таблица 4) из плазмиды pRS316CG.Рисунок 2. Физические карты плазмид pL-CUP1, pU-CUP1.