Диссертация (Изучение роли последовательностей, богатых аспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 11

Для оценки частоты индукциииспользовалось отношение количества клонов, выросших на среде без аденинак количеству клонов, выросших на среде с добавлением аденина.4.4 Молекулярно-биологические методыТрансформацию бактерий E. coli проводили по стандартной методике(Inoue et al., 1990). Трансформацию дрожжей также осуществляли постандартной методике с использованием ацетата лития (Rose et al., 1990).Выделение плазмидной ДНК из бактерий проводили методом щелочноголизиса (Sambrook et al., 1989).Выделение геномной ДНК из дрожжей проводили следующим образом(Lõoke et al., 2011). Небольшое количество дрожжевых клеток собирали с66чашки твердой среды YAPD, суспендировали в 100 мкл буфера (200мМLiOAc, 1% SDS) и инкубировали 15 минут при 70ºС.

Потом добавляли 300 мклэтанола, встряхивали и центрифугировали при 15000g в течение 3 минут.Затем удаляли супернатант, растворяли осадок в 100 мкл воды ицентрифугировали при 15000g 15 секунд. Супернатант переносили в новуюпробирку.Для сайт-специфического гидролиза плазмидной ДНК использовалиэндонуклеазы рестрикции производства “Thermo Fisher Scientific” (США) и“Promega” (США) в соответствии с протоколом компании-производителя.Для разделения и визуализации продуктов рестрикции и амплификацииДНК, использовали метод горизонтального гель-электрофореза в агарозномгеле.

Гель-электрофорез проводили в буфере ТАЭ (40 мМ Tris, 20 мМуксусной кислоты, 1 мМ ЭДТА) при напряженности электрического поля 5В/см. Для визуализации фрагментов ДНК в гель добавляли бромистый этидийв конечной концентрации 0,5 мкг/мл. В качестве маркера молекулярных весовиспользовали ДНК фага λ, гидролизованную эндонуклеазой рестрикцииHindIII, “Thermo Fisher Scientific” (США). Выделение фрагментов ДНК изагарозных гелей проводили с использованием набора «Выделение ДНК изагарозных гелей на магнитных частицах, покрытых SiO2» фирмы «Силекс М»(РФ) согласно протоколу производителя. Реакцию лигирования проводили,используя Т4 ДНК-лигазу (5 ед./мкл) производства “Thermo Fisher Scientific”(США) согласно протоколу производителя.Амплификацию фрагментов ДНК осуществляли методом полимеразнойцепной реакции (ПЦР) в термоциклере «Терцик» («ДНК-Технология», РФ),используя термостабильную полимеразу Phusion (“Thermo Fisher Scientific”,США).

Синтез праймеров производился компанией “Beagle” (РФ). Реакцииамплификации фрагментов ДНК проводили в следующих условиях:92ºС – 1 мин (1 цикл)92ºС – 25 сек, 50ºС – 25 сек, 72ºС – 1 мин (5 циклов)92ºС – 25 сек, 55ºС – 25 сек, 72ºС – 1 мин (25 циклов)6772ºС – 4 мин (1 цикл)Последовательностипраймеровдляамплификациипоследовательностей ДНК приведены в таблице 4.4.5 Белковый электрофорез и «Вестерн-блот» гибридизацияКлеточный лизат дрожжей получали с помощью метода разрушенияклеток стеклянными шариками (Newnam et al., 1999).Для определения того, какая доля целевого белка представлена в составеагрегатов, а какая находится в растворенном состоянии, проводилицентрифугирование дрожжевых клеточных лизатов (70000g 20 мин при 4ºC),после чего надосадочную фракцию переносили в новую пробирку, а к осадкудобавляли буфер в объеме, равном объему надосадочной фракции.Денатурирующий белковый форез проводили в 10% полиакриламидномгеле.

Перенос белков на PVDF Hybond-P мембрану осуществляли в трисглициновом буфере. Для оценки размера белков применяли маркермолекулярного веса “Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder” “ThermoFisher Scientific” (США).Для оценки размера агрегатов белков, а также анализа их устойчивостик действию детергентов использовали метод полуденатурирующего белковогоэлектрофореза в агарозном геле (SDD-AGE) (Bagriantsev et al., 2006;Kryndushkin et al., 2003) с модификациями.

В качестве детергентовиспользовали додецил-сульфат натрия (SDS) или лаурилсаркозинат натрия,присутствовавшие в буфере для нанесения в концентрациях 1% и 3%,соответственно. Белки инкубировали в буфере для нанесения в течение 10 минпри комнатной температуре, если не указано иное. Полуденатурирующийбелковый электрофорез проводили в 1% агарозном геле в буфере ТАЭ,содержащем 0,1% додецил-сульфата натрия или 0,3% лаурил-саркозинатанатрия, при напряженности электрического поля 5 В/м в течение 1,5 часов.68Перенос белков на PVDF Hybond-P мембрану осуществляли в буфере ТАЭ сдобавлением 20% этилового спирта и 1% додецил-сульфата натрия.«Вестерн-блот» гибридизацию проводили с использованием первичныхантител против GFP Ab-13970 “Sigma” (США) и вторичных моноклональныхантител к иммуноглобулинам кролика, конъюгированными с пероксидазойхрена производства “General Electric” (Великобритания).4.6 Конфокальная микроскопияАнализагрегациииколокализациибелков,слитыхссинимфлуоресцентным белком CFP и желтым флуоресцирующим белком YFP,проводили при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопаLeica TCS SP5 “Leica Microsystems GmBH” (Германия) (Центр коллективногопользования СПбГУ «Хромас») и лазерного сканирующего конфокальногомикроскопа Leica TCS SP5 MP “Leica Microsystems GmBH” (Германия)(РесурсныйцентрСПбГУ«Развитиемолекулярныхиклеточныхтехнологий»).

Условия: для CFP – возбуждающий лазер 458 нм, запирающийфильтр 462-510 нм, для YFP – возбуждающий лазер 514 нм, запирающийфильтр 518-580 нм, для DAPI – возбуждающий лазер 405 нм, запирающийфильтр 425-475 нм. Микроскопию проводили на вторые сутки выращиванияштаммов на селективной среде.Дляприготовлениямикропрепаратовдрожжевыеклеткисуспендировали в стерильной воде и равномерно распределяли поповерхности предметных стекол “Polylysine slides” (“Gerhard Menzel GmBH”,Германия). После высыханияводы, препаратызаключалив среду“VECTASHIELD Mounting Media” (“Vector Laboratories”, США) или“VECTASHIELD Mounting Media with DAPI” (“Vector Laboratories”, США) дляокраски красителем DAPI, и накрывали покровными стеклами.69Для расчета частоты агрегации количество клеток, в которыхвыявлялись агрегаты, делилось на общее количество клеток, в которыхвыявлялся сигнал флуоресцентного белка.Для определения частоты колокализации агрегатов выбирались клетки,вкоторыхприсутствовалисигналыобоихисследуемыхбелков,иопределялось количество клеток, в которых локализация этих сигналовсовпадает.4.7 Разработка алгоритма SARP для поиска последовательностей,богатых аспарагином и глутаминомАлгоритм SARP (Sequence Analysis Based on the Ranking of Probabilities,анализ последовательности, основанный на ранжировании вероятностей)реализованнаязыкеC#(https://msdn.microsoft.com/ru-ru/library/618ayhy6.aspx).

Пороговое значение вероятности было 10-12.Минимальный размер скользящего окна был равен 25 аминокислотам. Дляпроведения сравнения скорости работы алгоритмов был использован набор изтысячи последовательностей дрожжевых белков, выбранных случайнымобразом.4.8 Протеомный скрининг и идентификации амилоидовМетод протеомного скрининга и идентификации амилоидов (ProteomicScreening and Identification of Amyloids, PSIA) (Nizhnikov et al., 2014) позволяетискать белки, которые образуют амилоиды, в масштабах всего протеома иоснован на особенности амилоидных белков формировать агрегаты,устойчивые к обработке детергентами.

Метод состоит из двух этапов:выделенияфракциибелковыхагрегатов,устойчивыхкобработкедетергентами, и идентификации входящих в состав этих агрегатов белков. Врамкахданнойработыидентификация70осуществляласьметодомвысокоэффективной жидкостной хроматографии, совмещенной с массспектрометрией (HPLC-MALDI) (Antonets et al., 2016).4.8.1 Выделение фракции белковых агрегатов, устойчивых кобработке детергентамиВыделение фракции белковых агрегатов проводили по описанной ранееметодике с модификациями. Для этого культуру дрожжей выращивали двоесуток в 400 мл селективной среды, после чего осаждали при 2500g 10 мин при4ºС.

Затем клетку суспендировали в 5 мл буфера (50 мМ Tris-HCl, pH 7.6, 150мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ PMSF, 10 мМ DTT) и добавляли равный объемстеклянных бус (0,4 мм GLC, Merck-BDH). Клетки разрушали надезинтеграторе “Fisher Scientific” (США) шесть циклов по одной минуте сперерывом на одну минуту для охлаждения проб на льду. Затем пробыосаждали при 2500g 10 мин 4ºС и отбирали надосадочную фракцию, к которойдобавляли 5 мг РНКазы, после чего инкубировали 30 минут при 30ºС.Белковый лизат наслаивали на 2 мл сахарозной подушки (25% сахароза вбуфере TBS) и ультрацентрифугировали 2 часа при 223600g при 4ºС в ротореTi75.

Затем осадок суспендировали в 6 мл буфера с 1% SDS и инкубировали 6часов при температуре 18ºС. Пробы ультрацентрифугировали 8 часа при223600g при 18ºС в роторе Ti75 с 2 мл сахарозной подушки. Осадоксуспендировали в 8 мл воды и центрифугировали 2 часа при 223600g при 18ºС.Осадок, состоящий из детергент-устойчивых белковых агрегатов, высушивалив вакуумном испарителе 1 час при 40º, растворяли в 100 мкл 96% муравьинойкислоты и снова высушивали.