Диссертация (Изучение роли последовательностей, богатых аспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 14

Мы проанализировали влияние на агрегацию QN-богатогоучастка Gln3 таких хорошо изученных дрожжевых прионов, как [PIN+] и[PSI+].5.4.1 Изучение влияния [PIN+] и [PSI+] на агрегацию QN-богатогофрагмента белка Gln3Для изучения влияния прионов [PIN+] и [PSI+] на агрегацию QNбогатого фрагмента белка Gln3 штаммы OT56 [PSI+][PIN+], 2-D-701 [PSI+][pin], 1-OT56 [psi-][PIN+] и 2-OT56 [psi-][pin-] были трансформированы плазмидойpU-CUP1-GLN3QN-YFP. Трансформанты были отобраны на селективнойсреде с добавлением 150 мкМ CuSO4 и через 48 часов инкубации проводилсяанализ агрегации белков при помощи конфокальной микроскопии.Фрагмент белка Gln3 с 166 по 242 аминокислоту, богатый аспарагиноми глутамином, образует множественные глобулярные и точечные агрегаты независимо от наличия или отсутствия в штамме прионов [PSI+] и [PIN+](Рисунок 21).

Стоит отметить, что, поскольку QN-богатая последовательностьбелка Gln3 не содержит последовательности ядерной локализации, агрегаты89белка Gln3QN-YFP имели строго цитоплазматическую локализацию (Рисунок21).Рисунок 21. Белок Gln3QN-YFP формирует агрегаты не зависимо от прионов[PIN+] и [PSI+]. DAPI – канал для детекции DAPI, красителя, специфичносвязывающегося с ДНК и маркирующего ядро; Gln3QN-YFP – канал длядетекции YFP, все штаммы продуцируют белок Gln3QN-YFP, поэтому на этомканали детектируется именно он; Совмещение – наложение каналов длядетекции DAPI, YFP и фазового контраста.

Масштабная линейка – 5мкм.В то же время, прионы [PSI+] и [PIN+] оказывали существенное влияниена частоту образования флуоресцентных фокусов Gln3QN-YFP. Наибольшаячастота видимых агрегатов Gln3QN-YFP детектировалась в клетках штамма[psi-][PIN+] и была значимо выше, чем в остальных штаммах (p<0,01) (Рисунок22). Наименьшая частота была отмечена в клетках штамма [psi-][pin-]. Таким90образом, прион [PSI+] повышает долю клеток с агрегатами QN-богатогоучастка Gln3 в [pin-] штаммах, но подавляет их образование в [PIN+].Рисунок 22. Процент клеток с агрегатами Gln3QN-YFP зависит от статуса[PIN+] и [PSI+].

(p<0.01) означает, что процент клеток с агрегатами в данныхштаммах различается на уровне значимости 0,01.РазличиевагрегацииGln3QN-YFPмеждунаиболеесильноотличающимися по частоте образования флуоресцентных фокусов штаммами[psi-][PIN+]и[psi-][pin-]такжебылоподтвержденоспомощьюультрацентрифугирования клеточных лизатов, выделенных из этих штаммов споследующей Вестерн-блот гибридизацией.

Белок, образующий крупныеагрегаты, выявляется в осадочной фракции, а растворимый мономерный белок– в надосадочной. В штамме [PIN+] больше белка Gln3QN-YFP детектируетсяв осадочной фракции, в то время как в штамме [pin-] находятся в основном внадосадочной фракции (Рисунок 23).91Рисунок 23. Сравнение агрегации белка Gln3QN-YFP в штаммах [psi-][PIN+] и[psi-][pin-] с помощью ультрацентрифугирования клеточных лизатов.

Т –тотальный лизат – лизат, не подвергавшийся разделению на фракции спомощью ультрацентрифугирования; Н – надосадочная фракция клеточноголизата; О – осадочная фракция клеточного лизата.Следующим нашим шагом была проверка устойчивости агрегатов,формируемых белком Gln3QN-YFP, к обработке детергентами.

Агрегаты,образуемые этим белком, разрушались до мономеров при обработке додецилсульфатом натрия (Рисунок 24), однако были устойчивы к обработке лаурилсаркозинатом натрия. Полученные данные показывают, что полимерыGln3QN-YFP, устойчивые к обработке этим детергентом, образуются во всехпроанализированных штаммах (Рисунок 24).Рисунок 24. Gln3QN-YFP образует агрегаты, устойчивые к обработке лаурилсаркозинатом натрия, но не додецил-сульфатом натрия, независимо отдрожжевых прионов [PIN+] и [PSI+].92Таким образом, прионы [PSI+] и [PIN+] не оказывают эффекта ни наспособность QN-богатого участка Gln3 агрегировать, ни на биохимическиесвойства образующихся агрегатов, но существенно влияют на частотуформирования агрегатов.5.4.2 Анализ колокализации QN-богатого фрагмента белка Gln3 сбелками Sup35 и Rnq1В предыдущем разделе было показано влияние прионов [PSI+] и [PIN+]на частоту формирования флуоресцентных фокусов Gln3QN-YFP, поэтомуможно было предположить, что это влияние опосредовано взаимодействиемGln3QN-YFP со структурными белками этих прионов: Sup35 для [PSI+] и Rnq1для [PIN+].

Мы проверили эту гипотезу с помощью анализа колокализацииGln3QN-YFP с Sup35NM-CFP и Rnq1-CFP. Для этого штаммы OT56[PSI+][PIN+], 2-D-701 [PSI+][pin-], 1-OT56 [psi-][PIN+] и 2-OT56 [psi-][pin-] былико-трансформированыплазмидойpU-CUP1-GLN3QN-YFP,атакжеплазмидой для сверхпродукции прион-формирующего участка Sup35, слитогос CFP (pCUP1-SUP35NM-CFP), или плазмидой для сверхпродукции Rnq1,слитого с CFP (pCUP1-RNQ1-CFP(LEU2)).

Трансформанты были отобраны населективной среде с добавлением 150 мкМ CuSO4 и через 48 часов инкубациипроводился анализ колокализации белков при помощи флуоресцентнойконфокальной микроскопии.Флуоресцентные фокусы Gln3QN-YFP колокализуются с фокусамибелка Rnq1-CFP с частотой, близкой к 100% во всех проанализированныхштаммах [PIN+] (Рисунок 25 и Рисунок 26).

В штаммах [pin-] белок Rnq1-CFPобразует видимые агрегаты крайне редко, и анализ колокализации в нихневозможен.93Рисунок 25. Агрегаты Gln3QN-YFP колокализуются с агрегатами белка Rnq1CFP в [PIN+] штаммах. Gln3QN-YFP – канал для детекции YFP, все штаммыпродуцируют Gln3QN-YFP; Rnq1-CFP – канал для детекции CFP, все штаммыпродуцируют белок Rnq1-CFP; Совмещение – наложение каналов YFP, CFP ифазового контраста. Масштабная линейка – 5мкм.Рисунок 26. Доля клеток, в которых наблюдается колокализация агрегатовGln3QN-YFP с Sup35NM-CFP или Rnq1-CFP. (p<0.05) означает, что процентклеток с агрегатами в данных штаммах различается на уровне значимости 0,05.94Хотя агрегаты Gln3QN-YFP колокализуются и с агрегатами белкаSup35NM-CFP в штаммах [PSI+][PIN+], [PSI+][pin-] и [psi-][PIN+] (в штамме [psi][pin-] Sup35NM-CFP не агрегирует), но частота колокализации этих белков непревышает 50% (Рисунок 26 и Рисунок 27).

Это согласуется с данными о том,что прион [PSI+], хотя и влияет на частоту агрегатов Gln3QN-YFP, но не таксильно, как прион [PIN+].Рисунок 27. Агрегаты Gln3QN-YFP частично колокализуются с агрегатамиSup35NM-CFP. Gln3QN-YFP – канал для детекции YFP, все штаммыпродуцируют белок Gln3QN-YFP; Sup35NM-CFP – канал для детекции CFP,все штаммы продуцируют Sup35NM-CFP; Совмещение –наложение каналовYFP, CFP и фазового контраста. Масштабная линейка – 5мкм.В целом, хотя агрегаты Gln3QN-YFP выявляются даже в штамме [psi][pin-], прион [PIN+] оказывает значительное влияние на агрегацию Gln3QN95YFP.

В то же время [PSI+] является лишь модификатором эффектов [PIN+].Последний существенно увеличивает частоту появления агрегатов Gln3QNYFP, а [PSI+], в свою очередь, подавляет эффект [PIN+].966 Обсуждение6.1 Влияние замен глутамина на аспарагин или фенилаланин в Nтерминальном домене белка Sup35 на его свойстваВ ходе работы было изучено влияние аминокислотного состава наспособность N-терминального домена белка Sup35 агрегировать.

В отличие отработ, выполненных в лаборатории Э. Росса, где переставляли местамифрагменты последовательности N-домена (Shewmaker et al., 2008; Toombs etal., 2011), в данном исследовании мы сохранили последовательностьаминокислот, но все остатки глутамина заменяли на аспарагин (Sup35NN) илифенилаланин (Sup35NF) (Рисунок 12).

Вариант N-домена с заменамиглутамина на аспарагин, слитый с желтым флуоресцентным белком YFP,формировал агрегаты в [PIN+], но не в [pin-] штамме, как и нативный вариантN-домена (Sup35Nwt) (Рисунок 14). С помощью метода полуденатурирующегоэлектрофореза в агарозном геле (SDD-AGE) было показано, что Sup35NN-YFPформирует в [PIN+] клетках детергент-устойчивые полимеры такой жемолекулярной массы, как и Sup35Nwt-YFP (Рисунок 15).

Полученныерезультаты объясняются сходством физико-химических свойств аспарагина иглутамина и хорошо согласуются с данными, полученными в лаборатории С.Линдквист (Halfmann et al., 2011). В той работе было показано, что заменааспарагина на глутамин в N-домене Sup35 усиливает прионные свойства.Вариант N-терминального домена Sup35 с заменами глутамина нафенилаланин сильно отличался по свойствам от нативного варианта N-домена.Он формировал агрегаты независимо от статуса [PIN+] (Рисунок 14). Этоможет объясняться тем, что фенилаланин обладает большей амилоидогеннойспособностью, чем глутамин (по: Ahmed and Kajava, 2013a). Различие всвойствах фенилаланин и глутамина приводит к тому, что Sup35NF-YFPагрегирует даже в [pin-] штаммах (Рисунок 14).