Диссертация (Изучение роли последовательностей, богатых аспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза у дрожжей saccharomyces cerevisiae)
Описание файла
Файл "Диссертация" внутри архива находится в папке "Изучение роли последовательностей, богатых аспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза у дрожжей saccharomyces cerevisiae". PDF-файл из архива "Изучение роли последовательностей, богатых аспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза у дрожжей saccharomyces cerevisiae", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве СПбГУ. Не смотря на прямую связь этого архива с СПбГУ, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст из PDF
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТБИОЛОГО-ПОЧВЕННЫЙ ФАКУЛЬТЕТКАФЕДРА ГЕНЕТИКИ И БИОТЕХНОЛОГИИНа правах рукописиАнтонец Кирилл СергеевичИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ,БОГАТЫХ АСПАРАГИНОМ И ГЛУТАМИНОМ, ВИНДУКЦИИ АМИЛОИДОГЕНЕЗА У ДРОЖЖЕЙSaccharomyces cerevisiaeспециальность: 03.02.07 – генетикаДИССЕРТАЦИЯна соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:доктор биологических наук, доцентГалкин Алексей ПетровичСанкт-Петербург2016ОглавлениеОглавление ............................................................................................................... 21 Список сокращений .............................................................................................
52 Введение ................................................................................................................ 73 Обзор литературы. Амилоиды и их взаимодействие ..................................... 123.1 Определение термина «амилоид».................................................................. 123.2 История формирования представлений об амилоидах ............................... 123.2.1 Описание заболеваний, связанных с амилоидами ....................................
123.2.2 Изучение структуры амилоидов ................................................................. 153.2.3 Определение состава амилоидов ................................................................ 163.3 Разнообразие амилоидов ................................................................................ 183.3.1 Патологические амилоиды .......................................................................... 183.3.2 Функциональные амилоиды........................................................................ 213.3.3 Прионы как подгруппа амилоидов .............................................................
232.3.3.1 Прионы млекопитающих .......................................................................... 242.3.3.2 Прионы грибов .......................................................................................... 272.3.3.2.1 Фактор [PSI+] .......................................................................................... 312.3.3.2.1 Фактор [PIN+] .......................................................................................... 333.4 Структура амилоидов ..................................................................................... 343.4.1 Особенности аминокислотной последовательности ................................
343.4.2 Особенности пространственной структуры амилоидов .......................... 383.5 Взаимодействие амилоидов ........................................................................... 413.6 Методы идентификации амилоидов.............................................................. 443.6.1 Биоинформатические методы .....................................................................
443.6.2 Биохимические методы ............................................................................... 4723.7 Заключение ...................................................................................................... 494 Материалы и методы .........................................................................................
514.1 Штаммы микроорганизмов, среды и условия культивирования ............... 514.2 Плазмиды ......................................................................................................... 524.2.1 Плазмиды, полученные в данной работе ................................................... 544.3 Генетические методы ...................................................................................... 654.4 Молекулярно-биологические методы ........................................................... 664.5 Белковый электрофорез и «Вестерн-блот» гибридизация ..........................
684.6 Конфокальная микроскопия........................................................................... 694.7 Разработка алгоритма SARP для поиска последовательностей, богатыхаспарагином и глутамином ............................................................................ 704.8 Протеомный скрининг и идентификации амилоидов ................................. 704.8.1 Выделение фракции белковых агрегатов, устойчивых к обработкедетергентами .................................................................................................... 714.8.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография, совмещенная с массспектрометрией (HPLC-MALDI) ................................................................... 724.9 Предсказание β-арок .......................................................................................
734.10 Статистические методы ................................................................................ 735. Результаты.......................................................................................................... 745.1 Анализ амилоидогенных свойств вариантов N-терминального доменаSup35 с заменами глутамина на аспарагин и фенилаланин........................ 745.1.1 Изучение способности вариантов N-терминального домена Sup35агрегировать..................................................................................................... 745.1.2 Изучение способности вариантов N-домена Sup35 индуцироватьприонизацию нативного белка Sup35 ...........................................................
775.2 Изучение влияния аминокислотных замен в N-домене Sup35 на индукциюамилоидогенеза других белков в протеоме дрожжей ................................. 8035.2.1 Выявление потенциально амилоидогенных белков методом PSIA-HPLCMALDI ..............................................................................................................
805.2.2 Разработка нового алгоритма поиска потенциально амилоидогенныхбелков in silico ................................................................................................. 825.3 Изучение амилоидных свойств белка Mad1 ................................................. 855.4 Влияние прионов [PSI+] и [PIN+] на агрегацию QN-богатого фрагментабелка Gln3 ........................................................................................................
895.4.1 Изучение влияния [PIN+] и [PSI+] на агрегацию QN-богатого фрагментабелка Gln3 ........................................................................................................ 895.4.2 Анализ колокализации QN-богатого фрагмента белка Gln3 с белкамиSup35 и Rnq1 .................................................................................................... 936 Обсуждение......................................................................................................... 976.1 Влияние замен глутамина на аспарагин или фенилаланин в Nтерминальном домене белка Sup35 на его свойства ...................................
976.2 Влияние сверхпродукции N-домена Sup35 на индукцию амилоидогенезадругих белков в дрожжевом протеоме ....................................................... 1006.3 Белок Mad1 формирует амилоидоподобные олигомеры не зависимо отприсутствия агрегатов N-терминального домена Sup35........................... 1026.4 Прионы [PSI+] и [PIN+] оказывают различное влияние на агрегацию QNбогатого фрагмента белка Gln3 ................................................................... 1047 Заключение ....................................................................................................... 1078 Выводы .............................................................................................................. 1089 Список литературы ..........................................................................................
109Благодарности...................................................................................................... 13841 Список сокращениймкМ – микромольПЦР – полимеразная цепная реакцияЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислотаCFP – Cyan Fluorescent Protein (циановый флуоресцирующий белок)CUP1 – промотор дрожжевого гена CUP1, активируемый добавлением ионовмедиDAPI – 4,6- диамидино-2-фенилиндолDTT – dithiothreitol (дитиотреитол)GFP – Green Fluorescent protein (зелёный флуоресцирующий белок)GPD – конститутивный промотор гена S.
cerevisiae GPD1GuHCl – гидрохлорид гуанидинаHPLC-MALDI (или LC-MALDI) - Жидкостная хроматография, совмещенная смасс-спектрометриейLB – среда Luria-Bertani для культивирования E. coliMD – дрожжевая минимальная синтетическая среда с глюкозой в качествеисточника углеродаPMSF – phenylmethylsulfonyl fluoride (фенилметилсульфонил флуорид)PSIA – протеомный скрининг амилоидов (Proteomic Screening for Identificationof Amyloid proteins)поли-Q – polyglutamine (аминокислотная последовательность, содержащаярасположенные друг за другом остатки глутамина)PrP – Prion ProteinPVDF – Polyvinylidene Difluoride membrane (поливинилидендифтористаямембрана)QN-богатый – обогащенный аспарагином и глутаминомSc – scrapi (амилоидная конформация белка PrP)SDS – Sodium Dodecyl sulfate (додецилсульфат натрия)Sup35WT – полноразмерный нативный белок Sup355Sup35Nwt – нативный N-домен белка Sup35Sup35NN – вариант N-домена белка Sup35 с заменами всех остатков глутаминана остатки аспарагинаSup35NF –вариант N-домен белка Sup35 с заменами всех остатков глутаминана остатки фенилаланинаYAPD – дрожжевая питательная среда (1% дрожжевой автолизат, 2% бактопептон, 2% глюкоза)YFP – Yellow Fluorescent Protein (желтый флуоресцирующий белок)62 ВведениеАктуальность проблемы.Амилоидыпредставляютстабилизированныесобойкросс-β-слоями(по:белковыеGreenwaldandфибриллы,Riek,2010).Изначально формирование амилоидов связывали только с патологическимипроцессами (по: Nizhnikov et al., 2015).
