Диссертация (Изучение роли последовательностей, богатых аспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 10

PCUP1 –последовательность промотора дрожжевого гена CUP1. Здесь и на рисунке с 3по 11: PCUP1 – последовательность промотора дрожжевого гена CUP1; CEN6– участок дрожжевой центромеры; F1 ORI – ориджин репликации фага f1;ARSH4 – дрожжевой ориджин репликации; PMB1 – бактериальный ориджинрепликации; APr – бактериальный ген устойчивости к ампициллину; T3 P и T7P – последовательности, комплементарные соответствующим праймерам;URA3 и LEU2 – дрожжевые гены.55Таблица 4. Праймеры, использованные в работеНазваниеПоследовательностьGLN3QNHindIIIFTAATAAGCTTATGTCTCAATACAACCACGGTTCCGLN3QNBamHIR CTGATTGGATCCCTGGATATTACTATTGTTGCTCup1SalIFGCTGTCGACCTATACGTGCATATGTTCATGCup1Hind3RCGTAAGCTTTTGATTGATTGTACAGTTTGSup35NFBamCAGGGATCCATGTCGGATTCAAACCAAGGSup35MRSIITAGCCGCGGATCGTTAACAACTTCGTCATCCSup35NFBamCAGGGATCCATGTCGGATTCAAACCAAGGSup35N123RBgSAATGAGCTCCGTCAAGATCTACCTTGAGACTGTGGTTGGMadFHindCTCAAGCTTATGGATGTGAGAGCGGMadRBamTATGGATCCTTTGGCTTGTCGCTGMadPrFSalTATGTCGACGGCCACAATCTATAGAAAGMadPrRHindCGCAAGCTTTATTTACTATTACCTCTCGATTTTAПлазмиды pL-CUP1-CFP и pU-CUP1-YFP (Рисунок 3) были получены изплазмид pL-CUP1 и pU-CUP1 путем вставки фрагментов BamHI-SacI изплазмидциановыйpGPD-CFP(LEU2)(несетфлуоресцентныйбелокпоследовательность,CFP)икодирующуюpGPD-YFP(URA3)(несетпоследовательность, кодирующую желтый флуоресцирующий белок YFP).Плазмиды pL-CUP1-CFP и pU-CUP1-YFP содержат гены CFP и YFPсоответственноподконтролеминдуцибельногопромотораCUP1,бактериальный и дрожжевой ориджины репликации, ген APr и дрожжевыегены LEU2 (pL-CUP1-CFP) и URA3 (pU-CUP1-YFP).56Рисунок 3.

Физические карты плазмид pL-CUP1-CFP, pU-CUP1-YFP. PCUP1– последовательность промотора дрожжевого гена CUP1; CFP и YFP –последовательности, кодирующие флуоресцентные белки CFP и YFP,соответственно.Плазмида pU-CUP1-GLN3QN-YFP (Рисунок 4) была получена путемвставки в плазмиду pU-CUP1-YFP ПЦР-фрагмента, амплифицированного сгеномной ДНК штамма OT56 с помощью праймеров GLN3QNHindIIIF иGLN3QNBamHIR (Таблица 4) и несущего последовательность, кодирующуюфрагмент белка Gln3 с 166 по 242 аминокислоты, по сайтам рестрикции HindIIIи BamHI.

Плазмида содержит гибридный ген GLN3QN-YFP (кодирует слитыйбелок, состоящий из фрагмента белка Gln3 с 166 по 242 аминокислоту ижелтого флуоресцентного белка YFP) под контролем промотора CUP1,дрожжевой и бактериальный ориджины репликации и гены APr и URA3.57Рисунок 4. Физическая карта плазмиды pU-CUP1-GLN3QN-YFP. PCUP1 –последовательность промотора дрожжевого гена CUP1; YFP –последовательность, кодирующая флуоресцентный белок YFP; GLN3QN –последовательность, кодирующая богатый аспарагином и глутамином участокбелка Gln3.Плазмида pGPD-SUP35NM-CFP (Рисунок 5) получена путем заменыпоследовательности, кодирующей PrP23-231, на фрагмент, полученныйамплификацией последовательности SUP35NM плазмиды pmCUPNMsGFP спраймерами Sup35NFBam и Sup35MRSII (Таблица 4), по сайтам рестрикцииBamHI и SacII.

Плазмида содержит гибридный ген SUP35NM-CFP (кодируетслитый белок, состоящий из укороченного варианта белка Sup35, лишенногоC-терминального домена, и цианового флуоресцентного белка CFP) подконтролем промотора CUP1, дрожжевой и бактериальный ориджинырепликации и гены APr и LEU2.58Рисунок 5. Физическая карта плазмиды pGPD-SUP35NM-CFP. GPD –последовательность дрожжевого промотора GPD; CFP – последовательность,кодирующая флуоресцентный белок CFP; SUP35NM – последовательность,кодирующая N- и M-домены белка Sup35.ПлазмидыpUCup-Sup35Nwt,pUCup-Sup35NNиpUCup-Sup35NFпредназначены для продукции в дрожжевых клетках трех разных вариантовN-домена белка Sup35 с 1-й по 123 аминокислоту: нативного домена(Sup35Nwt), N-домена, в котором все остатки глутамина заменены на остаткиаспарагина, и варианта, в котором все остатки глутамина заменены на остаткифенилаланина, соответственно.

Каждая из этих трех плазмид содержит ген дляпродукции соответствующего варианта N-домена Sup35 под контролемпромотора CUP1, дрожжевой и бактериальный ориджины репликации и геныAPr и URA3.Плазмида pUCup-Sup35Nwt (Рисунок 6) была получена на основеплазмиды pRS316CG путем замещения фрагмента, кодирующего белок GFP,на ПЦР-фрагмент, кодирующий N-домен белка Sup35 (с 1 по 12359аминокислоту) и амплифицированный с плазмиды pGPD-SUP35NM-CFP спомощью праймеров Sup35NFBam и Sup35N123RBgS (Таблица 4), по сайтамBamHI и SacI.Рисунок 6.

Физическая карта плазмиды pUCup-Sup35Nwt. PCUP1 –последовательность промотора дрожжевого гена CUP1; SUP35Nwt –последовательность, кодирующая нативный N-домен белка Sup35.Плазмиды pUCup-Sup35NN и pUCup-Sup35NF (Рисунок 7) былиполучены аналогично плазмиде pUCup-Sup35Nwt, с той разницей, что вместоПЦР-фрагмента использовались последовательности, кодирующие вариант Nдомена белка Sup35 с заменами всех глутаминов на аспарагин (Sup35NN) и нафенилаланин (Sup35NF) соответственно. Эти последовательности былисинтезированы фирмой «Евроген» (РФ), приведены в Таблица 5.60Таблица 5 Последовательности, кодирующие модифицированные вариантыN-домена белка Sup35НазваниеПоследовательностьSup35NNGTCGGATCCATGTCCGATTCTAACTTTGGCAACAATTTCTTTAACTACTTCTTCTACAGCTTCAACGGTAACTTTTTCTTTGGTAACAACAGATACTTTGGTTATTTCGCTTACAATGCCTTTGCCTTTCCTGCTGGAGGCTACTACTTCAATTACTTTGGTTATTCTGGGTACTTCTTTGGTGGCTACTTCTTTTACAATCCCGACGCAGGTTACTTTTTCTTCTATAATCCTTTTGGAGGCTATTTCTTTTACAATCCATTTGGCGGTTATTTCTTCTTTTTCAATCCCTTTGGAGGTAGAGGCAATTACAAAAACTTCAACTACAATAACAATCTGTTTGGATACTTTGCTGGCTTCTTTCCATTCTCCTTTGGTAGATCTTGACGGAGCTCATTSup35NFGTCGGATCCATGTCCGATTCGAACAATGGCAACAACAATAACAACTACAATAACTACTCCAATAACGGTAACAATAACAATGGTAACAACAGATACAACGGTTATAACGCTTACAATGCCAATGCCAATCCTGCAGGTGGCTACTACAACAATTACAATGGTTACTCTGGCTACAATAACGGTGGCTACAACAACTACAATCCCGACGCCGGTTACAATAACAACTACAATCCTAATGGAGGCTACAATAACTACAATCCAAACGGTGGCTATAATAACAACTTCAATCCTAATGGTGGCAGAGGAAATTACAAGAACTTCAACTACAATAACAATCTGAACGGATACAATGCTGGATTCAATCCTAACTCCAACGGTAGATCTTGACGGAGCTCATT61Рисунок 7.

Физические карты плазмид pUCup-Sup35NN и pUCup-Sup35NF.PCUP1 – последовательность промотора дрожжевого гена CUP1; SUP35NN иSUP35NF – последовательность, кодирующая варианты N-домена белка Sup35с заменами всех остатков глутамина на остатки аспарагина и фенилаланинасоответственно.Плазмиды pUCup-Sup35Nwt-YFP (Рисунок 8), pUCup-Sup35NN-YFP иpUCup-Sup35NF-YFP (Рисунок 9) предназначены для продукции в дрожжевыхклетках гибридных белков, состоящих из одного из трех вариантов N-доменабелка Sup35: нативного домена (Sup35Nwt), N-домена, в котором все остаткиглутамина заменены на остатки аспарагина, или варианта, в котором всеостатки глутамина заменены на остатки фенилаланина, соответственно, ижелтого флуоресцирующего белка YFP. Каждая из трех плазмид содержитсоответствующий гибридный ген под контролем промотора CUP1, дрожжевойи бактериальный ориджины репликации и гены APr и URA3.ПлазмидыpUCup-Sup35Nwt-YFP, pUCup-Sup35NN-YFP иpUCup-Sup35NF-YFP были получены из плазмид pUCup-Sup35Nwt, pUCup-Sup35NN иpUCup-Sup35NF, соответственно, путем вставки по сайтам BglII и SacIфрагмента, кодирующего желтый флуоресцентный белок YFP.

Фрагмент YFPвырезали из плазмиды pU-CUP1-YFP по сайтам BamHI и SacI.62Рисунок 8. Физическая карта плазмиды pUCup-Sup35Nwt-YFP. PCUP1 –последовательность промотора дрожжевого гена CUP1; YFP –последовательность, кодирующая флуоресцентный белок YFP; SUP35Nwt –последовательность, кодирующая нативный N-домен белка Sup35.Рисунок 9. Физические карты плазмид pUCup-Sup35NN-YFP и pUCupSup35NF-YFP. PCUP1 – последовательность промотора дрожжевого генаCUP1; YFP – последовательность, кодирующая флуоресцентный белок YFP;SUP35NN и SUP35NF – последовательность, кодирующая варианты N-доменабелка Sup35 с заменами всех остатков глутамина на остатки аспарагина ифенилаланина соответственно.63Плазмида pLCup-Mad1-CFP (Рисунок 10) предназначена для продукциив дрожжевых клетках гибридного белка Mad1-CFP, состоящего из дрожжевогобелка Mad1 и цианового флуоресцентного белка CFP. Плазмида содержитгибридный ген MAD1-CFP под контролем индуцибельного промотора CUP1,дрожжевой и бактериальный ориджины репликации и гены APr и LEU2.Плазмида pLCup-Mad1-CFP была получена из плазмиды pL-CUP1-CFP путемвставки ПЦР-фрагмента, кодирующего дрожжевой белок Mad1, по сайтамрестрикции HindIII и BamHI.

ПЦР-фрагмент был получен с помощьюпраймеров MadFHind и MadRBam (Таблица 4) с использованием геномнойДНК дрожжей штамма GT159 в качестве матрицы.Рисунок 10. Физическая карта плазмиды pLCup-Mad1-CFP. PCUP1 –последовательность промотора дрожжевого гена CUP1; CFP –последовательность, кодирующая флуоресцентный белок CFP; MAD1 –последовательность дрожжевого гена MAD1.Плазмида pLMad1-Mad1-CFP (Рисунок 11) содержит гибридный генMAD1-CFPподконтролемпромотора64генаMAD1,дрожжевойибактериальный ориджины репликации и гены APr и LEU2 и была получена изплазмиды pLCup-Mad1-CFP путем замещения последовательности промоторагена CUP1 на последовательность промотора гена MAD1 по сайтамрестрикции SalI и HindIII.

Последовательность промотора была полученаметодом ПЦР с помощью праймеров MadPrFSal и MadPrRHind (Таблица 4).Рисунок 11. Физическая карта плазмиды pLMad1-Mad1-CFP. PMAD1 –последовательность промотора дрожжевого гена MAD1; CFP –последовательность, кодирующая флуоресцентный белок CFP; MAD1 –последовательность дрожжевого гена MAD1.4.3 Генетические методыВ работе были использованы стандартные генетические методы работыс дрожжами: метод селективных сред для проверки ауксотрофности штаммов,метод отпечатков, метод посева истощающим штрихом (Захаров et al., 1984;Инге-Вечтомов, 1971; Rose et al., 1990).

Для проверки стабильностинаследования фенотипа Ade+ дрожжевые клетки три раза пассировали на65твердой среде YAPD для потери плазмиды. После этого их клонировалиистощающим штрихом на среде YAPD, отбирали полученные клоны на средуYAPD, методом отпечатков переносили на среды YAPD, MD без добавленияурацила и MD без аденина и проводили фенотипический анализ полученныхклонов.

Проверка потери фенотипа Ade+ на среде с хлоридом гуанидинаосуществлялась трехкратным пассированием на твердой среде YAPD сдобавлением 5 мМ хлорида гуанидина “QIAGEN” (США). Затем индуктантовклонировалиистощающимштрихом на средеYAPD ипроводилифенотипический анализ полученных клонов.Для оценки частоты индукции фактора [PSI+] в штамме GT159,трансформированном плазмидами pUCup-Sup35Nwt-YFP, pUCup-Sup35NNYFP или pUCup-Sup35NF-YFP, проводили тест на разведение. Трансформантыдвукратно пассировались на твердой среде MD с добавлением 150 мкМ CuSO4.Далее трансформанты инокулировали в 10 мл жидкой селективной среды со100 мкМ CuSO4 и выращивали в течение трех суток при температуре 30ºС.После этого делали по пять десятикратных разведений каждого вариантатрансформантов (начиная с 10 мкл культуры) на чашки с селективной средойс добавлением и без добавления аденина.