Диссертация (Изучение роли последовательностей, богатых аспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 13

Трансформантов штамма GT159[psi-][PIN+], содержащие плазмиды pUCup-Sup35Nwt-YFP, pUCup-Sup35NNYFP, pUCup-Sup35NF-YFP или pUCup-YFP пассировали на среде сконцентрацией CuSO4 150 мкМ. Затем дрожжи переносили на среду безаденина с помощью метода отпечатков. Каждый полученный от независимоготрансформанта клон с фенотипом Ade+ был проверен на способностьстабильно поддерживать этот фенотип в ряду клеточных делений на полнойсреде YPD. Каждый клон, стабильно поддерживающий статус Ade+пассировали на среде с хлоридом гуанидина (Таблица 7). Клоны с фенотипомAde+, полученные при сверхпродукции Sup35Nwt-YFP и Sup35NN-YFP, терялиэтот фенотип при пассировании на среде с хлоридом гуанидина (Таблица 7).79Таблица 7.

Изгнание фенотипа Ade+ при пассировании на среде с хлоридомгуанидина (GuHCl)Отобранные Ade+Стабильные Ade+СтабильныекоторыеAde+,лечатсяGuHClSup35Nwt-YFP [PIN+]181717Sup35NN-YFP [PIN+]171612Таким образом, N-домен Sup35 с заменами глутамина на фенилаланиннеспособен индуцировать прион [PSI+] у нативного Sup35, а вариант сзаменами на аспарагин индуцирует [PSI+], хотя и менее эффективно, чемSup35Nwt.5.2 Изучение влияния аминокислотных замен в N-домене Sup35 наиндукцию амилоидогенеза других белков в протеоме дрожжей5.2.1 Выявление потенциально амилоидогенных белков методомPSIA-HPLC-MALDIСверхпродукция амилоидогенных белков с последовательностями,богатыми аспарагином и глутамином, может вызывать агрегацию другихбелков с такими участками.

Например, ранее в лаборатории М.Д. ТерАванесяна было показано, что сверхпродукция в дрожжах S. cerevisiaeфрагмента белка хантингтина, содержащего протяженный полиглутаминовыйучасток, вызывала агрегацию ряда дрожжевых белков с QN-богатымиучастками (Nizhnikov et al., 2014). Мы решили проверить, не вызывает лисверхпродукция Sup35Nwt-YFP и Sup35NN-YFP сходного эффекта. Были взятыварианты N-домена Sup35Nwt и Sup35NN, так как они взаимодействуют с двумядрожжевыми NQ-богатыми прионами. Rnq1 в прионной форме индуцирует ихагрегацию, а агрегация Sup35Nwt-YFP и Sup35NN-YFP, в свою очередь,индуцирует переход белка Sup35 в прионное состояние. Для идентификации80белков, которые могут формировать детергент-устойчивые агрегаты, былаиспользована модификация метода PSIA, в котором для разделения иидентификациибелковприменяласьжидкостнаяхроматография,совмещенная с масс-спектрометрией (HPLC-MALDI) (Antonets et al., 2016;Nizhnikov et al., 2014).

Этот метод базируется на универсальном свойствеамилоидных агрегатов – их устойчивости к обработке детергентами. Приобработке тотального лизата детергентами, такими как додецил-сульфатнатрия большинство белковых комплексов разрушается до мономеров иостается в надосадочной фракции, тогда как устойчивые крупные агрегатывыявляются в осадке. Так можно получить фракцию, обогащеннуюамилоидными белками, которые затем идентифицируются с помощьювысокоэффективной жидкостной хроматографии, совмещенной с массспектрометрией (HPLC-MALDI).Для анализа использовали штамм GT159 [psi-][PIN+], которыйтрансформировали плазмидами pUCup-Sup35Nwt-YFP и pUCup-Sup35NN-YFP.ВтрансформантахспомощьюметодаPSIA-HPLC-MALDIбылиидентифицированы 5 белков, которые не были выявлены в контроле (штаммGT159 [psi-][PIN+], трансформированный плазмидой pU-CUP1-YFP) (Таблица8).

В каждом случае анализ проводили в двух повторностях. Примечательно,что почти все идентифицированные белки, за исключением одного, быливыявлены только в клонах, продуцировавших Sup35NN-YFP, но не Sup35NwtYFP.81Таблица 8. Белки, формирующие агрегаты на фоне сверхпродукции Sup35NwtYFP и Sup35NN-YFP в штамме GT159 [psi-][PIN+]Название Белок индуктор Белок индуктор ОписаниебелкаSup35Nwt-YFPSup35NN-YFPCtt1-+Защита от оксидативного стрессаBur1-+Циклин-зависимая киназаAim39-+Связансподдержаниеммитохондриального геномаMad1+Вовлечен в чекпойнт сборки веретена+деленияAcc1-Ацетил-КоА карбоксилаза+Таким образом, нами было идентифицировано пять белков, которыеформируют SDS-устойчивые агрегаты на фоне сверхпродукции белкаSup35NN-YFP, но не в контроле. Из этих пяти белков один выявлялся такжепри сверхпродукции белка Sup35Nwt-YFP.5.2.2Разработкановогоалгоритмапоискапотенциальноамилоидогенных белков in silicoУ дрожжей S.

cerevisiae подавляющее большинство известных амилоидформирующих белков обогащены аспарагином и глутамином. Именно QNбогатые участки этих белков необходимы для их агрегации. Также агрегацияодних QN-богатых белков может вызывать агрегацию других QN-богатыхбелков. В рамках данной работы было решено проверить, не являются либелки, идентифицированные методом PSIA-HPLC-MALDI, обогащеннымиаспарагином и глутамином.Для поиска в белковых последовательностях участков, богатыхглутамином и аспарагином, существует алгоритм LPS (Harrison and Gerstein,822003). Этот алгоритм основан на том, что для каждого белка можно рассчитатьвероятность случайного формирования последовательности с заданнымколичеством остатков той или иной аминокислоты.

Участок с наименьшейвероятностью будет наиболее обогащен этой аминокислотой. Путем переборавсех возможных участков заданной белковой последовательности находитсятакой участок, для которого эта вероятность будет наименьшей. Однакоалгоритм LPS является очень ресурсоемким. Нами была создана модификацияэтого алгоритма – SARP (Antonets and Nizhnikov, 2013).В отличие от исходного алгоритма, разработанный нами алгоритм неперебирает все возможные фрагменты последовательности, а ищет участкификсированной длины с наименьшей вероятностью возникновения. Затемграницы таких участков расширяются, пока не будет достигнута минимальноезначение вероятности (Рисунок 17).

Модифицированный алгоритм правильнонаходит границы всех участков, которые находит оригинальный алгоритм, и вто же время дает выигрыш по времени работы на два порядка (Рисунок 18).83Рисунок 17. Схема работы алгоритма SARP84Рисунок 18. Сравнение скорости работы алгоритмов LPS и SARP взависимости от длины белковой последовательности на входе. По горизонталиотложены наборы белковых последовательностей, сгруппированных по длине,а по вертикали – отношение средней скорости работы алгоритма LPS к SARPдля каждой группы белков.Мы применили разработанный нами алгоритм SARP для поискаучастков, богатых аспарагином и глутамином, у белков, выявленных спомощью PSIA-HPLC-MALDI в ходе предыдущего этапа работы. Только уодного из 5 идентифицированных белков – у Mad1, был обнаружен участок,обогащенный аспарагином.5.3 Изучение амилоидных свойств белка Mad1В предыдущем разделе мы показали, что единственный Q/Nобогащённый белок, который выявлялся методом PSIA-HPLC-MALDI на фонеагрегации Sup35NN-YFP, был Mad1.

Мы решили детальнее исследоватьамилоидные свойства этого белка.85Для оценки амилоидных свойств Mad1 мы получили плазмиды pLCup1Mad1-CFPиpLMad1-Mad1-CFP,которыепозволяютпродуцироватьхимерный белок Mad1-CFP в дрожжах под контролем индуцибельногопромотора гена CUP1 и собственного промотора гена MAD1 соответственно.Штамм GT159 [psi-][PIN+] ко-трансформировали плазмидой pLCup1Mad1-CFP и одной из плазмид pUCup-YFP, pUCup-Sup35Nwt-YFP или pUCupSup35NN-YFP.Полученныетрансформантыпассировалина средесдобавлением 150 мкМ CuSO4.

Белок Mad1-CFP формировал глобулярныеагрегаты,детектируемыеприпомощиконфокальногомикроскопа,независимо от использованного для сверхпродукции варианта N-домена белкаSup35 (Рисунок 19).Рисунок 19. Агрегация белка Mad1-CFP и его колокализация с белкамиSup35Nwt-YFP и Sup35NN-YFP. CFP – канал для детекции циановогофлуоресцентного белка CFP; YFP – канал для детекции желтогофлуоресцентного белка YFP; Совмещение – наложение каналов для детекцииCFP, YFP и фазового контраста. Масштабная линейка – 5мкм.86Важно отметить, что агрегаты белка Mad1-CFP колокализовались сагрегатами белка Sup35Nwt-YFP с частотой 22,58±7,51%, в то время как доляколокализации белка Mad1-CFP с Sup35NN-YFP составляла 61,82±6,55%.Таким образом, частота колокализации с агрегатами N-домена Sup35 сзаменами на аспарагин у белка Mad1 была значимо выше (p=0,00028).Следующимнашимшагомявляласьпроверкаустойчивостиформируемых белком Mad1 агрегатов к обработке детергентами, такими какдодецил-сульфат натрия.

Часть химерного белка Mad1-CFP присутствовала ввиде устойчивых к обработке SDS олигомеров и при сверхпродукции, и припродукции под контролем промотора гена MAD1 (Рисунок 20). Эти олигомерывыдерживали обработку 1% SDS как при комнатной температуре, так и при60ºС, не зависимо от того, продуцировался ли белок вместе с Sup35Nwt-YFP,Sup35NN-YFP или YFP.87Рисунок 20.

Устойчивость агрегатов Mad1-CFP к обработке додецилсульфатом натрия. Представлены результаты полуденатурирующего гельэлектрофореза в агарозном геле (SDD-AGE) с 1% додецил-сульфатом натрия.Верхний гель –продукция белка Mad1-CFP осуществлялась под контролемсобственного промотора гена MAD1. Нижний гель –продукция белка Mad1CFP осуществлялась под контролем индуцибельного промотора гена CUP1 насреде с добавлением 100 мкМ CuSO4. 95ºС, 60ºС, 20ºС – температураинкубации белка перед нанесением пробы на гель. Sup35Nwt, Sup35NN –продукция белка Mad1-CFP осуществлялась на фоне сверхпродукции белковSup35Nwt и Sup35NN соответственно.

Контроль – продукция белка Mad1-CFPосуществлялась на фоне контрольной плазмиды pU-CUP1.Таким образом, белок Mad1 способен формировать амилоидоподобныеолигомеры в дрожжевых клетках.885.4 Влияние прионов [PSI+] и [PIN+] на агрегацию QN-богатогофрагмента белка Gln3В предыдущих разделах мы изучали способность QN-богатыхпоследовательностей на примере разных вариантов N-домена Sup35индуцировать амилоидогенез других белков.

Следующим этапом являетсяизучение влияния прионов на агрегацию QN-богатых последовательностей. Вкачестве такой последовательности мы взяли богатый аспарагином иглутамином фрагмент белка Gln3. Ранее было показано, что этот участок Gln3,слитый с YFP, способен агрегировать в штамме [PIN+] (Alberti et al., 2009), ноне известно, агрегирует ли он в штамме [pin-], и, в целом, оказывают ливлияние на его агрегацию другие амилоиды, богатые аспарагином иглутамином.