Диссертация (Изучение роли последовательностей, богатых аспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 12

Затем осадок растворяли в 90 мкл воды,добавляли 30 мкл буфера (100 мМ Tris-HCl, pH 6,8, 20% меркаптоэтанол, 10%SDS) и кипятили 10 мин при 100ºС.714.8.2Высокоэффективнаяжидкостнаяхроматография,совмещенная с масс-спектрометрией (HPLC-MALDI)Для удаления детергентов и обессоливания проб использовали колонкиHiPPR Detergent Removal column и Zebra Desalting column (“Thermo FisherScientific”, США) в соответствии с протоколом изготовителя.

Затем к 50 мклпробы добавляли 1 мкл свежеприготовленного раствора 50 мМ DTT в 50 мМбикарбоната аммония и инкубировали 15 минут при 50ºС. После этогодобавляли 1 мкл раствора 100 мМ йодацетамида в 50 мМ бикарбонатеаммония и инкубировали в темноте 15 минут при 20ºС. Затем йодацетамидингибировали добавлением 1 мкл DTT, добавляли 5 мкл раствора трипсина (10нг/мкл, “Sigma”, США) и инкубировали ночь при 37ºС. Для инактивациитрипсина добавляли 0,5 мкл 10% раствора трифторуксусной кислоты, потомпробы центрифугировали 30 минут 20000g при 4ºС. 1 мкл полученной смесипептидов наносили на обратнофазную колонку HPLC Acclaim™ PepMap 300(150 мм × 75 мкм, размер частиц 5 мкм, “Thermo Fisher Scientific”, США).После этого смесь пептидов разделяли в градиенте ацетонитрила (2-90%) 45минут с использованием высокоэффективного нанопоточного жидкостногохроматографа UltiMate 3000 UHPLC+ RSLCnano (Dionex).

Для нанесенияфракций пептидов каждые 10 с на 384-луночную подложку MTP AnchorChip™800/384 (“Bruker Daltonics”, США) использовали автоматический коллекторфракций Proteineer fc II (“Bruker Daltonics”, США). В качестве стандартовиспользовали Peptide calibration standard II 8222570 (“Bruker Daltonics”, США),а в качестве матрицы использовали α-циано-4-гидроксикоричная кислота. Дляидентификации пептидов использовали Ultraflextrime (“Bruker Daltonics”,США). Для определения уникальных пептидов для каждой фракции получалиMS-спектр, который анализировали с использованием программы WARP-LC.Во фракциях, где концентрация этих пептидов максимальна, проводилиMS/MS.

Для идентификации белков использовали программное обеспечениеMascot 2.4.2 (Matrix Science, http://matrixscience.com) с базой данных NCBI72(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Для оценки достоверности идентификациибелка использовали показатель «счет масс-спектрометрии», вычисляемый поалгоритму MOWSE. Отбирали белки со счетом масс-спектрометрии не ниже30.

Проверку идентификации белков проводили вручную с использованиемпрограммного пакета BioTools (“Bruker Daltonics”, США).4.9 Предсказание β-арокДля предсказания β-арок, формируемых вариантами N-терминальногодомена Sup35, использованными в работе, использовали программуArchCandy с настройками по умолчанию (Ahmed et al., 2015).4.10 Статистические методыДоверительный 95% интервал для доли вычисляли по стандартнойформуле (Newcombe, 1998). Для сравнения частот индукции использовалинепараметрический метод Крускала-Уоллиса (Kruskal and Wallis, 1952) спопарным сравнением с помощью теста Данна (Dunn, 1964).

Для сравнениядолей клеток с агрегатами, частот колокализации и количества клонов,потерявшихфенотипаAde+,использовалимножественноепопарноесравнение точным тестом Фишера (Fisher, 1932). Для множественныхпопарных сравнений значение p получали с использованием поправки пометодуБенжаминииХохберга(BenjaminiandHochberg,1995).Доверительный 95% интервал для отношения скоростей работы алгоритмоввычисляли по методу, предложенному Хаслером (Hasler and Hothorn, 2008).735. Результаты5.1 Анализ амилоидогенных свойств вариантов N-терминальногодомена Sup35 с заменами глутамина на аспарагин и фенилаланин5.1.1 Изучение способности вариантов N-терминального доменаSup35 агрегироватьДля изучения роли последовательностей, богатых аспарагином иглутамином (QN-богатых), в амилоидогенезе мы использовали способностьдрожжевого белка Sup35 формировать амилоиды при переходе в прионноесостояние [PSI+].

Были получены плазмиды pUCup-Sup35Nwt-YFP, pUCupSup35NN-YFP и pUCup-Sup35NF-YFP для сверхпродукции в дрожжевыхклетках нативного N-домена белка Sup35 (Sup35Nwt), N-домена, в котором всеостатки глутамина заменены на остатки аспарагина (Sup35NN), и N-домена сзаменой всех остатков глутамина на фенилаланин (Sup35NF) (Рисунок 12).Рисунок 12. Последовательности вариантов N-терминального домена Sup35.Цветом выделены: красный – глутамин; зеленый – аспарагин; синий –фенилаланин. Под названием каждого варианта приведено процентноесодержание аспарагина, глутамина и фенилаланина.74Программой ArchCandy (Ahmed et al., 2015) были предсказаны β-арки,которые могут формировать последовательности Sup35Nwt, Sup35NN иSup35NF (Рисунок 13).

Несмотря на замену большой доли аминокислотраспределение предсказанных для Sup35NN β-арок было точно таким же, каки для Sup35Nwt (Рисунок 13). Для Sup35NF программа ArchCandy непредсказала некоторые варианты β-арок, предсказанных для Sup35Nwt. Вцелом, набор арок, предсказанный для Sup35NF, был аналогичен набору дляSup35Nwt (Рисунок 13).Рисунок 13.

Результат предсказания β-арок программой ArchCandy дляпоследовательностей Sup35Nwt, Sup35NN и Sup35NF. По горизонталиотложены позиции в аминокислотной последовательности. По вертикали –суммарный счет для всех β-арок, предсказанных для данной точки впоследовательности. Синие полосы обозначают участки, которые программааннотировала как неструктурированные. Коричневые полосы – участки,которые программа посчитала трансмембранными доменами.

Розовая полоса– последовательность, которую программа определила как сигнальныйпептид.Одной из задач, поставленных в рамках данного исследования, былапроверкаспособноститакихвариантовSup35Nформироватьамилоидоподобные агрегаты. Для этого изогенные штаммы дрожжей S.cerevisiae GT159 [psi-][PIN+] и GT174 [psi-][pin-] были трансформированыплазмидами pUCup-Sup35Nwt-YFP, pUCup-Sup35NN-YFP и pUCup-Sup35NFYFP. В штамме [PIN+] все варианты N-домена белка Sup35 формировалиагрегаты,детектируемыеприпомощилазерногосканирующегоконфокального микроскопа (Рисунок 14) Sup35NN-YFP, как и Sup35Nwt-YFP,75формировали точечные и лентообразные агрегаты, а Sup35NF-YFP – точечныеи глобулярные. В штамме [pin-] Sup35NF-YFP формировал агрегаты, тогда какSup35NN-YFP и нативный вариант N-домена, слитый с YFP, были равномернораспределены по цитоплазме дрожжевых клеток.

Стоит отметить, что вариантс заменами на фенилаланин формировал точечные или глобулярные агрегаты,как правило, один на клетку, как в [pin-], так и в [PIN+] штаммах (Рисунок 14).Рисунок 14. Агрегация белков Sup35Nwt-YFP, Sup35NN-YFP и Sup35NF-YFP вштаммах [pin-] и [PIN+]. YFP – канал для детекции желтого флуоресцентногобелка YFP; ФК – фазовый контраст; Совмещение – наложение каналов YFP ифазового контраста. Масштабная линейка –5мкм.Важным свойством многих амилоидов является их устойчивость кобработке детергентами (Kryndushkin et al., 2003; Mitsui et al., 2006; Peretz etal., 2006). Мы проверили, формируют ли Sup35NN и Sup35NF полимеры,устойчивые к обработке додецил сульфатом натрия. С помощью методаполуденатурирующего гель-электрофореза в агарозном геле (SDD-AGE) былопоказано, что в штамме [PIN+] Sup35NN-YFP образует полимеры, устойчивыек обработке детергентом, аналогично Sup35Nwt-YFP (Рисунок 15).

В штамме[pin-] нативный N-домен и N-домен с заменами глутамина на аспарагинприсутствовали только в мономерной форме. Sup35NF-YFP формировалдетергент-устойчивые олигомеры в [pin-] и в [PIN+] штаммах, но они были76существенно легче, чем агрегаты Sup35Nwt-YFP и Sup35NN-YFP (Рисунок 15).В целом, полученные результаты позволяют говорить о том, что варианты Nдомена с заменами глутамина на аспарагин и фенилаланин могут формироватьамилоидоподобные агрегаты в дрожжевых клетках.Рисунок 15.

Устойчивость к обработке додецил-сульфатом натрия агрегатов,формируемых белками Sup35Nwt-YFP, Sup35NN-YFP и Sup35NF-YFP вштаммах [pin-] и [PIN+]. (К) – кипяченный белок; (Н) – не кипяченный белок.5.1.2ИзучениеспособностивариантовN-доменаSup35индуцировать прионизацию нативного белка Sup35Важным свойством QN-богатых последовательностей является ихспособность к кросс-индукции агрегации, явлении, когда амилоидная формаодного белка может индуцировать агрегацию другого, как в случае [PIN+] и77Sup35. Мы решили проверить, будут ли варианты N-домена Sup35 с заменамиглутамина на аспарагин или фенилаланин индуцировать состояние [PSI+] убелка Sup35 дикого типа.

С этой целью штамма GT159 [psi-][PIN+]трансформировали плазмидами pUCup-Sup35Nwt-YFP, pUCup-Sup35NN-YFP,pUCup-Sup35NF-YFPилиpUCup-YFP(отрицательныйконтроль).Трансформанты пассировали на среде с концентрацией CuSO4 150 мкМ длясверхпродукции соответствующих белков. Затем дрожжи высевались сериейпоследовательных десятикратных разведений на среду, не содержащуюаденин, для селекции клонов, в которых произошла индукция фактора [PSI+].В четырех повторностях было показано, что сверхпродукция белка Sup35NNYFP приводила к появлению клонов c Ade+ фенотипом с большей частотой(р=0,043), чем в отрицательном контроле (Таблица 6).

В то же время этачастота была меньше, чем на фоне сверхпродукции белка Sup35Nwt-YFP(Рисунок 16). Клоны, трансформированные плазмидой pUCup-Sup35NF-YFP,не отличались от отрицательного контроля.Рисунок 16. Индукция Ade+ клонов в тестах на разведение послесверхпродукции разных вариантов N-домена Sup3578Таблица 6. Частота индукции фенотипа Ade+ в контроле и на фонесверхпродукции Sup35Nwt-YFP, Sup35NN-YFP и Sup35NF-YFPПовторность, № YFP, [PIN+]Sup35Nwt-YFP,Sup35NN-YFP,Sup35NF-YFP,[PIN+][PIN+][PIN+]100,6970,000030200,4710,000030300,6320,000070400,7180,000060Чтобы убедится, что при сверхпродукции Sup35NN-YFP происходитиндукция именно фактора [PSI+], а не мутации в гене ADE1, мы проверилиспособность полученных клонов с фенотипом Ade+ терять этот фенотип послепассирования на среде с хлоридом гуанидина.