Диссертация (Изучение роли последовательностей, богатых аспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 7

Помимо этого, фактор [PIN+] проявляется в повышеннойчастоте спонтанного возникновения [PSI+] и способствует агрегациихимерных белков Sup35NM-GFP (Derkatch et al., 2001) или Rnq-GFP (Douglaset al., 2009).Открытие фактора [PIN+] стало первой демонстрацией взаимодействиймежду разными прионами.

Помимо повышения частоты возникновения [PSI+],[PIN+] увеличивает частоту индукции [URE3], а присутствие [PSI+] или [URE3]способствует индукции [PIN+] (Derkatch et al., 2001). Также, было показано,что[PIN+]повышаетчастотуиндукцииприонизациирядапоследовательностей, слитых с Sup35MC (Alberti et al., 2009). Все этопозволяет предположить наличие в клетках дрожжей сложных «прионныхсетей» взаимодействий между различными прионами.3.4 Структура амилоидов3.4.1 Особенности аминокислотной последовательностиВсе амилоиды характеризуются наличием общей структуры.

Длябольшинства растворимых белков сходство пространственной укладки белковсоответствует сходству аминокислотной последовательности этих белков.Чем более похожи две аминокислотные последовательности, тем болеесходными должны быть структуры белков. На этом, во многом основанысовременные методы предсказания структуры и функций белков.Интересно, что для амилоидов не было обнаружено подобнойзакономерности. Совершенно разные последовательности могли формироватьамилоидные фибриллы с очень похожей пространственной организацией (по:Uversky and Fink, 2004).

На основе этого было высказано предположение, что34способность формировать амилоиды является свойством полипептидногоостова (по: Dobson, 1999). Исходя из этой гипотезы, все белки потенциальномогутформироватьамилоиды,норадикалыаминокислотмогутпрепятствовать этому. Такое предположение очень сильно усложнило задачуопределения«амилоидогенногомотива»,посколькувместопоискапоследовательности, склонной к формированию амилоидов, нужно былоискать последовательность, которая бы этому не препятствовала.Темнеменее,удалосьобнаружитьнекоторыеособенностиаминокислотных последовательностей амилоидов. Амилоидные фибриллыхарактеризуются наличием β-цепей, перпендикулярных оси фибриллы (по:GreenwaldandRiek,2010).Такимобразом,последовательностьаминокислотных остатков, формирующих такие фибриллы, должна бытьсклонна формировать β-цепи (по: Hamodrakas, 2011).

Например, пролин неявляется амилоидогенной аминокислотой, так как не содержит аминогруппы,а также вызывает изгиб полипептидной цепи, что препятствует образованиюбета-цепи.Принято считать, что для формирования амилоидной фибриллыдостаточно наличия в аминокислотной последовательности коротких (поразным оценкам от 6 до 12 аминокислот) участков с высокой склонностью камилоидогенезу (Esteras-Chopo et al., 2005; López de la Paz and Serrano, 2004).Для оценки амилоидогенных свойств участков белка используютразличные свойства аминокислот, такие как гидрофобность, заряд и ряддругих характеристик (Chiti et al., 2003).

В зависимости от подхода, оценкиамилоидогенностиаминокислотмогутварьировать.Наиболееамилоидогенные по разным оценкам алифатические аминокислоты (лейцин,изолейцин, валин) и ароматические (триптофан, тирозин, фенилаланин) (по:Ahmed and Kajava, 2013b). Стоит отметить, что короткие последовательностис высокой амилоидогенностью встречаются во многих белках, но тольконебольшая доля белков формирует амилоиды при физиологических условиях(по: Cascarina and Ross, 2014). Возможно, это связано с тем, что такие «горячие35точки» амилоидогенности скрыты внутри белковой молекулы и не могутвзаимодействовать с другими молекулами.

Это предположение хорошосогласуется с тем, что ряд коротких пептидов склонен к формированиюамилоидов, такие как пептид амилоид-бета (Iwatsubo et al., 1994) или гормонычеловека (Maji et al., 2009). Интересно отметить роль естественного отбора вформировании горячих точек амилоидогенности. Известно, что чем вышеконцентрация белка, тем выше вероятность индукции амилоидогенеза. Былопоказано, что белки с более высоким уровнем продукции менее склонны кформированию амилоидных фибрилл (Tartaglia et al., 2007; Tartaglia andVendruscolo, 2009). Таким образом, мажорные белки, функционирующие вмономерном состоянии, в ходе эволюции избавились от последовательностей,склонных к амилоидогенезу.Стоит отметить, что наличие коротких участков с высокой склонностьюк амилоидогенезу не всегда является основной характеристикой амилоидныхбелков. Так, большинство дрожжевых прионов содержит относительнопротяженные области, богатые остатками аспарагина и глутамина (HarrisonandGerstein,2003;последовательности,по:Nizhnikovобогащенныеetal.,некоторыми2016).Действительно,аминокислотами,илигомопептиды склоны формировать амилоиды (Oma et al., 2004).

Важно, чтоспособность к амилоидогенезу у гомополимеров зависит не только от свойстваминокислоты, но и от длины последовательности. Так, белок хантингтин учеловека содержит полиглутаминовый тракт, длина которого можетварьировать. Если длина тракта менее 30 остатков глутамина, то белок неагрегирует. Если в результате экспансии тринуклеотидных повторов длинатракта станет близка к ста остаткам и больше, то белок начнет формироватьамилоидные фибриллы, что приведет к развитию болезни Хантингтона(Schilling et al., 1999).Таким образом, можно выделить группу амилоидогенных протяженныхпоследовательностей, обогащенных одной или двумя аминокислотами.

Однойиз наиболее изученных групп таких последовательностей являются прионные36домены дрожжевых белков. Для них характерно обогащение остаткамиаспарагина и глутамина (QN-богатые последовательности). Интересно, чтоаспарагин обладает более сильными прионогенными свойствами (Halfmann etal., 2011). Был исследован вариант белка Sup35, в прионном домене котороговсе остатки глутамина заменили на аспарагин. В клетках дрожжей, которыепродуцировали такой белок вместо нативного Sup35, прион [PSI+] возникал сбольшей частотой и наследовался стабильнее. Наоборот, замена всехаспарагинов на глутамины в прионном домене Sup35 приводила кнеспособности формировать прион (Halfmann et al., 2011).Стоит отметить, что для QN-богатых последовательностей важнееаминокислотный состав, а не взаимное расположение аминокислотныхостатков (Toombs et al., 2011).

Это было показано на примере прионногодомена Sup35. Сверхпродукция вариантов прионного домена, полученныхслучайной перестановкой фрагментов, приводила к их агрегации. Более того,такие агрегаты стабильно воспроизводились в ряду поколений, то естьобладали прионными свойствами (Shewmaker et al., 2008; Toombs et al., 2011).Помимо аспарагина и глутамина, существенный вклад в прионные свойстваQN-богатых последовательностей вносят и другие аминокислоты, что былопоказано на основе изучение аминокислотного состава прионного доменабелка Sup35 (Toombs et al., 2010).

Сходные данные были получены приисследовании вставок различных аминокислот в полиглутаминовый трактбелкахантингтина.аминокислотБыло(тирозина,установлено,фенилаланиначтоивставкатриптофана)ароматическихспособствуетфрагментации агрегатов (Alexandrov et al., 2012). Именно благодаряфрагментации фибрилл возможно поддержание дрожжевых прионов в рядупоколений (Chernoff et al., 1995).Наоснованииданных,полученныхдляQN-богатыхпоследовательностей, было сделано предположение, что оптимальнымиприонными доменами являются протяженные неструктурированные участки сумеренными амилоидогенными свойствами (по: Cascarina and Ross, 2014;37Toombs et al., 2012). Если бы такие участки были обогащены гидрофобнымиаминокислотами,тоонибывсегдаформировалиамилоидыивыбраковывались в ходе естественного отбора.На настоящий момент можно утверждать, чо никакой консенсуснойамилоидогеннойформироватьпоследовательностиамилоидныенефибриллысуществует.могутсамыеПо-видимому,разныепопоследовательности белки и пептиды, а многие амилоидогенные участкивозникали независимо друг от друга.3.4.2 Особенности пространственной структуры амилоидовВсеамилоидыобъединяетналичиесходнойпространственнойструктурой.

Амилоидные белки формируют протяженные неразветвленныефибриллы, образованные большим количеством белковых молекул (по:Greenwald and Riek, 2010). Длина таких фибрилл может достигать несколькихмикрометров при диаметре порядка десяти нанометров.

Структура фибриллыстабилизирована тем, что каждая молекула белка образует β-цепи,перпендикулярные оси фибриллы. β-цепи, расположенные друг за другом,объединяются в единый β-слой, тянущийся вдоль всей фибриллы (Рисунок 1).Таким образом, каждый протофиламент можно представить в виде стопкиочень длинных β-слоев, параллельных его оси. Расстояние между β-цепямисоставляет примерно 4,7 Å, а расстояние между слоями варьирует от 6 до 11 Å(Sunde et al., 1997) (Рисунок 1). Такая организация амилоидной фибриллыполучила название кросс-β-слой и была предсказана на основе дифракциирентгеновских лучей.

Интересно, что структура, сходная с кросс-β-слоем,была описана еще в 1935 В. Астбери при исследовании денатурированногояичного белка (Astbury et al., 1935). Это открытие было сделано за несколькодесятилетий до того, как были идентифицированы первые амилоидные белки.38Рисунок 1. Модель организации амилоидной протофиламента. Голубыми икрасными лентами обозначены β-цепи, образующие два β-слоя. (Petkova et al.,2002)Хотя общие принципы организации амилоидной фибриллы былиописаны еще в первой половине XX века, определение точной структурыамилоидных фибрилл оказалось довольно сложной задачей.

Одним изнаиболееразрешенияраспространенныхявляетсяметодоврентгеновскаяполученияструктуркристаллография,длявысокогокоторойнеобходимо получение кристаллов исследуемого белка. Однако, протяженныеодномерные фибриллы очень плохо формируют трехмерные кристаллы (по:Greenwald and Riek, 2010). Проблему удалось частично решить сиспользованием короткихпептидов, которые способныформироватьмикрокристаллы со структурой, отражающей структуру фибрилл. В то жевремя, это не решает полностью проблему расшифровки структурыамилоидов, поскольку фибриллы, формируемые короткими пептидами, могут39отличаться от того, что образуют полноразмерные белки, а микрокристаллымогут отличаться от фибрилл по структуре (Wel van der et al., 2007).Другим активно используемым методом изучения структур амилоидовявляется твердотельный ядерный магнитный резонанс.