Диссертация (Изучение роли последовательностей, богатых аспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 8

Именно благодаряэтому методу была получена модель в высоком разрешении фибриллы,сформированной прионным доменом HET-s (Wasmer et al., 2008; Wasmer et al.,2009).Кросс-β-слои являются общим элементом структуры всех амилоидов. βслои объединяются между собой за счет наличия у каждого β-слоя «сухих» и«мокрых» поверхностей (Nelson et al., 2005). В составе протофиламента слоирасположены «сухая» к «сухой» поверхности и «мокрая» к «мокрой».Расстояние между соседними β-слоями, обращенными друг к другу«мокрыми» поверхностями, составляет около 15 Å, и пространство междуними заполнено молекулами воды.

Такая пара β-слоев удерживается друг сдругом за счет образования водородных связей. Расстояние между слоями,обращенными друг у другу «сухими» поверхностями существенно меньше –около 8,5 Å, и между ними отсутствуют молекулы воды. «Сухие» поверхностиудерживаются вместе за счет ван-дер-Вальсовых взаимодействий. Из-за оченьблизкого расположения «сухих» поверхностей аминокислотные радикалы,расположенные друг напротив друга и смыкаются наподобие застежки«молния». Эта структура получила название «стерической молнии» (Nelson etal., 2005). Если каждая пара «сомкнутых» β-цепей принадлежит одноймолекуле белка, то такую стерическую молнию называют «β-аркадой», амотив β-цепь-поворот-β-цепь – «β-аркой» (по: Kajava et al., 2010). Такимобразом, большинство структур амилоидных протофиламентов можнопредставить в виде комбинации β-аркад.Не смотря на сходство структуры, амилоидные фибриллы разных белковмогут быть устроены по-разному (по: Riek, 2016).

В некоторых случаях дажеодин белок или пептид может формировать несколько разных амилоидныхструктур. Разнообразие обеспечивается за счет варьирования структуры на40разных уровнях организации. β-цепи в составе β-слоя могут располагатьсяпараллельно и антипараллельно (по: Riek, 2016). Для ряда дрожжевых прионовпоказано наличие параллельных слоев (по: Wickner et al., 2010), в то же времянекоторыефрагментыпептидабета-амилоидасклонныформироватьантипараллельные β-слои (Colletier et al., 2011).

Помимо этого, внутри самихβ-слоев β-цепи могут располагаться с разным смещением друг относительнодруга: «в регистре» (когда β-цепи в составе одного β-слоя точно выровненыдруг относительно друга) и не в регистре (когда β-цепи идут с некоторымсмещением) (Colletier et al., 2011). Также, разные участки пептида или белкамогут образовывать β-цепи при индукции формирования кросс-β-слоев(Colletier et al., 2011). На уровне образования фибриллы протофиламентымогут быть расположены по-разному друг относительно друга.Отдельно стоит отметить, что некоторые белки формируют амилоидныефибриллы, сильно отличающиеся по своей структуре от классической модели.К примеру, прионный домен HET-s формирует особую структуру – бетасоленоид (Wasmer et al., 2008; Wasmer et al., 2009). В бета-соленоиде каждаямолекула формирует два спиральных витка с двумя парами β-цепей.

Такимобразом, большое количество вариантов построения фибрилл порождаетразнообразие амилоидных структур.Все амилоиды имеют общую структуру, основанную на образованиикросс-β-слоев. В то же время, благодаря различным способам формированияэтих β-слоев, существует много вариаций амилоидных фибрилл.3.5 Взаимодействие амилоидовНа настоящий момент накоплено большое количество данных о том, чторазличные амилоидные белки могут взаимодействовать между собой. Вчастности, амилоидные фибриллы одного белка могут индуцироватьагрегацию другого.41Лучше всего такое взаимодействие изучено для дрожжевых прионов.Так, наличие приона [PIN+] повышает частоту возникновения [PSI+] (Derkatchet al., 1997).

Сходный эффект вызывает прион [SWI+] (Du and Li, 2014) исверхпродукция ряда других белков с QN-богатыми фрагментами (Derkatch etal., 2001). Стоит отметить, что на этапе индукции [PSI+] белок Sup35взаимодействует с агрегатами Rnq1 в [PIN+] штаммах. В то же время, в[PSI+][PIN+] штаммах агрегаты Sup35 и Rnq1 не колокализуются (Derkatch etal., 2004). Взаимодействие для этих белков важно только на этапе индукции.На основе этих данных была выдвинута гипотеза несовершенных матриц:фибриллы Rnq1 с некоторой частотой могут присоединять молекулы Sup35,что приводит к переходу Sup35 в амилоидное состояние. В то же время из-заразличий в аминокислотной последовательности, присоединение Sup35 кфибриллам Rnq1 происходит существенно реже, чем к фибриллам Sup35.Таким образом, когда возникли фибриллы Sup35, поддержание приона [PSI+]происходит независимо от фактора [PIN+] (Derkatch et al., 2004).Важно отметить, что Sup35, Rnq1, Swi1 и другие белки, сверхпродукциякоторых способствует индукции [PSI+], в основном содержат QN-богатыеучастки.

Большинство белков, не содержащих QN-богатых участков, невзаимодействуют с белком Sup35 и не индуцируют его агрегацию in vitro(Derkatch et al., 2004). На основании этого можно сделать вывод, чтонекоторые амилоидные фибриллы QN-богатых белков могут индуцироватьамилоидогенез других QN-богатых белков. Действительно, в лабораторииМ.Д. Тер-Аванесяна было показано, что сверхпродукция в дрожжевых клеткахполиглутаминового фрагмента хантингтина приводит к агрегации ряда QNбогатых белков (Nizhnikov et al., 2014).Стоит отметить, что QN-богатые дрожжевые прионы в ряде случаевоказывают антагонистическое воздействие друг на друга.

Так, некоторыеварианты приона [PIN+] повышают частоту потери слабых вариантов приона[PSI+]. Прионы [PSI+] и [URE3] не совместимы, скрещивание штаммов,несущих эти прионы, приводит к потере одного из них (Schwimmer and42Masison, 2002). Присутствие в штамме прионов [PSI+], [PIN+] и [SWI+]приводит к высокой частоте потери последнего (Du and Li, 2014).

Механизмытакого антагонистического взаимодействия до сих пор остаются невыясненными.Изучение взаимодействия амилоидов имеет и важное практическоезначение, поскольку индукция амилоидогенеза у человека может приводить ксерьезным заболеваниям. Известно, что агрегация пептида Aβ индуцируетгиперфосфорилирование и агрегацию белка тау (по: Hernández and Avila,2008). Наряду с присутствием агрегатов тау вместе с агрегатами Aβ приболезни Альцгеймера, они встречаются при некоторых формах синдромаГерштманна-Штройслера-Шейнкера вместе с агрегатами PrP (Ghetti et al.,1989)и при Британской (Revesz et al., 1999) или Датской деменции с BRI2 (по:Goedert et al., 2010). Также было показано, что агрегация тау можетстимулироваться формированием агрегатов α-синуклеина при болезниПаркинсона (по: Lei et al., 2010; Riedel et al., 2009).

Более того, эти два белкамогут формировать совместные агрегаты: их находили в телах Леви инейрофибриллярных клубках (Arai et al., 2001; Piao et al., 2001). Такимобразом, не только тау может образовывать фибриллы при болезниПаркинсона, но и присутствие агрегатов пептида Aβ может стимулироватьформирование олигомеров этого белка (Tsigelny et al., 2008). В свою очередь,присутствие прионных агрегатов PrPSc может приводить к более активномуформированию бляшек Aβ (Morales et al., 2010).Можно сделать вывод, что присутствие амилоидных фибрилл одногобелка может индуцировать амилоидогенез ряда других белков. Такой каскадамилоидогенеза может влиять на функционирование всего организма.

В то жевремя, очень мало известно о том, сколько белков вовлечено в эти процессы.Это связано с тем, что до недавнего времени отсутствовали методы,позволяющие выявлять амилоиды в масштабах всего протеома, поэтомуневозможно было определить, какие белки начинают агрегировать вприсутствии того или иного амилоида.433.6 Методы идентификации амилоидов3.6.1 Биоинформатические методыВсвязисразвитиемсовременныхметодовполногеномногосеквенирования количество новых последовательностей белков растетлавинообразно. Это приводит к необходимости автоматизированногопредсказания свойств белков на основе их последовательности. Предсказаниеамилоидных свойств представляет собой важную и сложную задачу. Как ужеотмечалосьвразделе«2.4.1Особенностиаминокислотнойпоследовательности», для амилоидов не существует единой консенсуснойпоследовательности.

В связи с этим при предсказании амилоидных свойствприходится использовать более общие знания о свойствах и особенностяхамилоидов.Все существующие на настоящий момент биоинформатические методыпредсказания амилоидных свойств белка можно разделить на две группы (по:Caflisch, 2006). Первая группа нацелена на выявление особенностей ваминокислотнойпоследовательностиизвестныхамилоидов,которыепозволяют отличить амилоидогенный белок от неамилоидогенного.

Втораягруппа методов ориентирована на использование особенностей структурыамилоидных фибрилл. Такие методы ищут белковые последовательности,способные сформировать кросс-β-слои (по: Caflisch, 2006).Как уже отмечалась, для формирования амилоидов зачастую достаточноналичия в составе белка короткого амилоидогенного участка (Esteras-Chopo etal., 2005; López de la Paz and Serrano, 2004). Многие программы,ориентированные на последовательность белка, нацелены на поиск такихкоротких участков. Для оценки «амилоидогенности» фрагмента белкаиспользуются различные физико-химические характеристики аминокислот,входящих в состав этого фрагмента.

Так, может применятся гидрофобностьаминокислот (Chiti et al., 2003), количество ароматических кислот (Tartaglia et44al., 2004), плотность упаковки аминокислот (Galzitskaya et al., 2006) и другиесвойствааминокислот.аминокислотмогутТакже,различныеиспользоватьсядлясочетаниявычисленияхарактеристиккомплекснойхарактеристики амилоидогенности.

Такой способ был применен в программахAggrescan (Conchillo-Solé et al., 2007) и Zyggregator (Tartaglia and Vendruscolo,2008). Другие методы использует полученные экспериментально данные окоротких пептидах для предсказания коротких амилоидогенных мотивов.Примером подобного метода является Waltz (Maurer-Stroh et al., 2010).Интересный подход был предложен в лаборатории С. Хамодракаса.

Впрограммах AMYLPRED (Frousios et al., 2009) и AMYLPRED2 (Tsolis et al.,2013) происходит объединение результатов предсказаний несколькихнезависимых программ. В результате получается консенсусное предсказаниеамилоидогенных мотивов.Известно, что многие дрожжевые прионы содержат протяженные QNбогатые участки. Это свойство было использовано еще в 2000 году длясоставления так называемого «списка Вейсмана» из 107 дрожжевых белков(Michelitsch and Weissman, 2000).

Та же идея поиска QN-богатыхпоследовательностей легла в основу алгоритма LPS, предложенного П.Гаррисоном и М. Герштейном (Harrison and Gerstein, 2003). В отличие отметода Вейсмана, который учитывал просто количество остатков аспарагинаи глутамина на участке заданной длины, алгоритм LPS использовалвероятность возникновения последовательности.

Чем сильнее частотааминокислотынанекоторомучасткеотличаласьотчастотыэтойаминокислоты в протеоме организма, тем меньше была вероятностьслучайного возникновения такого участка. Использование вероятностипозволило искать последовательности производной длины (Harrison andGerstein, 2003).Еще один метод поиска прионных доменов был предложен в работеАлберти c cоавторами (Alberti et al., 2009).

Метод использовал скрытую«марковскую модель», полученную на основе известных на тот момент45прионных дрожжевых доменов. Хотя метод не был направлен на поиск именноQN-богатых последовательностей, известные на тот момент прионные доменыбыли обогащены аспарагином и глутамином. В результате, подавляющеебольшинство предсказанных методом белков также были обогащеныаспарагином и глутамином (Alberti et al., 2009).Метод, учитывающий в целом аминокислотный состав протяженногоучастка белка и направленный на поиск белков, обладающих прионнымисвойствами, был разработан в лаборатории Э.

Росса (Toombs et al., 2012). Этотметод,получившийназваниеPAPA,былоснованнаполученныхэкспериментально данных о влиянии состава аминокислот на прионныесвойства.Другая группа методов для предсказания амилоидных свойств основанана использовании информации о пространственной структуре полипептиднойцепи.Известно, что для формирования амилоидной фибриллы белок долженбыть способен формировать β-цепи. На предсказании β-цепей основаныметоды TANGO (Fernandez-Escamilla et al., 2004) и PASTA (Trovato et al.,2007).