Диссертация (Изучение роли последовательностей, богатых аспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 6

Следующим был открыт фактор [PIN+],наличие которого повышало частоту индукции фактора [PSI+] (Derkatch et al.,2001; Derkatch et al., 1997). Детерминантом [PIN+] оказался белок Rnq1 снеизвестной функцией (Derkatch et al., 2001). В последующем был открыт ещеряд прионов дрожжей. Важно отметить, что концепция прионов (“protein only”– «только белок»), предполагает, что за передачу инфекционных свойствотвечают только белковые молекулы, и это не обязательно связано самилоидогенезом (Roberts and Wickner, 2003). Всего на настоящий моментизвестно девять прионов дрожжей S.

cerevisiae с идентифицированнымибелками-детерминантами (Таблица 1). Следует заметить, что большинстводрожжевых прионов вовлечено в регуляцию транскрипции и трансляции (по:Nizhnikov et al., 2016).28Таблица 1. Идентифицированные прионы S. cerevisiaeПрион[URE3]Белок/генUre2[PSI+]/URE2Sup35Rnq1/[β]*//СнижениеПовышениечастотыиндукциинекоторых(Lacroute,катаболизма азотаWickner, 1994)терминации (Cox, 1965; Wickner,трансляции eRF31994)(Derkatch et al., 2001;Неизвестна, влияет на Derkatch et al., 1997;споруляциюбелковприазотномSondheimerandсростаВакуолярная(Roberts and Wickner,протеиназа2003)нанекоторыми Регулятор хроматинаисточниками углерода/ Увеличение продукции Транскрипционныйизо-2-цитохрома сCYC81971;Lindquist, 2000)Нарушение деградациисредахОписан в работеРепрессорФакторэффективностиСнижениеSWI1Cyc8бедныхголоданииSwi1 /[OCT+]потреблениеприоновPRB1[SWI+]Преимущественноетерминации трансляцииRNQ1Prb1структурного белкаисточников азотаSUP35[PIN+]ФункцияЭффект прионизациирепрессор(Alberti et al., 2009;Du et al., 2008)(Patel et al., 2009)Контроль[MOT3+]Mot3/ многоклеточностигеновMOT3и Транскрипционныйанаэробного фактор(Alberti et al., 2009)метаболизма[ISP+]*[MOD+]Sfp1SFP1Mod5MOD5/Антисупрессиянекоторыхнонсенс-мутаций/ УстойчивостьТранскрипционныйфакторк Биосинтезнекоторым фунгицидамизопентиладенозина(Rogoza et al., 2010)Suzuki et al., 2012*связь с амилоидогенезом не установленаВ 2009 году в лаборатории С.

Линдквист был проведен поискдрожжевых прионов (Alberti et al., 2009). Из всех белков дрожжей S. cerevisiaeс помощью скрытой марковской модели были отобраны две сотни белков с29участками, наиболее похожими на прионные домены (последовательности,необходимые для поддержания прионного состояния). После этого былапроверена способность выявленных прионных доменов формироватьприоноподобные агрегаты. Таким образом был найден прион [MOT3+] (Albertiet al., 2009). Интересно, что некоторые выявленные белки взаимодействовалис уже известными дрожжевыми прионами.

Так, одним из белков, фрагменткоторого формировал прионоподобные агрегаты, был Gln3 (Alberti et al.,2009). Этот белок является транскрипционным фактором и репрессируетсяUre2, белком-детерминантом приона [URE3] (Bertram et al., 2000).Отдельно стоит выделить прион [Het-s] – фактор, обнаруженный умицелиального гриба Podospora anserine (Coustou et al., 1997). У этого грибаможет происходить слияние гифов, при этом образуется гетерокарион. Внекоторых случаях слияние приводит к гибели гифа. Этот процессрегулируется генами несовместимости, один из которых, het-s, представлендвумя аллелями: het-s и het-S.

Продукт аллели het-s может существовать в двухвариантах: в нативной конформации [Het-s*] и прионном состоянии [Het-s](Coustou et al., 1997). При слиянии гифов [Het-s*] и [Het-s] весь белок HET-s вгетерокарионе переходит в прионное состояние.

Слияние гифа, несущегоаллель het-S, и гифа [Het-s] приводит к несовместимости и гибелигетерокариона (Coustou et al., 1997; Wickner, 1997).Открытиедрожжевыхприоновспособствовалопрогрессувисследовании прионов в целом. Так, именно на дрожжевой модели впервыебыла доказана концепция “protein only” (Tanaka and Weissman, 2006), иизучены такие важные аспекты прионной биологии, как взаимодействиемежду прионами (Derkatch et al., 2001).Далее более подробно рассмотрены прионы [PSI+] и [PIN+], посколькуони были использованы в данной работе.302.3.3.2.1 Фактор [PSI+]Фактор [PSI+] дрожжей S.

cerevisiae был описан в середине 60-х годовXX века (Cox, 1965). Он проявлялся в том, что подавлял проявление нонсенсмутаций, при этом независимо от типа стоп-кодона, то есть являлсяомнипотентным нонсенс-супрессором (или аллосупрессором) (Chernoff et al.,1995; Liebman and Sherman, 1979; Palmer et al., 1979). Таким образом, если врамке считывания какого-либо дрожжевого гена в результате мутацийпоявлялся преждевременный стоп-кодон, то в штаммах [PSI+] этот кодончитался как кодирующий аминокислоту, что приводило к синтезуполноразмерного белка. На этом свойстве основана система фенотипическогопроявления фактора [PSI+].

В штаммах дрожжей, маркированных нонсенсмутацией ade1-14 наличие [PSI+] приводит к тому, что с некоторой частотойсинтезируется полноразмерный белок Ade1. Этот белок участвует вбиосинтезе аденина, и его наличие позволяет клеткам дрожжей расти на средебез аденина.В середине 90-х годов было выдвинуто предположение, что фактор[PSI+] является прионной формой белка Sup35 (Wickner, 1994). Оноподтверждалось рядом накопленных к тому моменту данных.

Так, наличие Nтерминальной последовательности гена SUP35 было необходимо дляподдержания фактора (Ter-Avanesyan et al., 1993), а сверхпродукция Sup35приводила к возникновению [PSI+] de novo (Chernoff et al., 1993). Более того,фенотип фактора [PSI+] был сходен с проявлением некоторых мутаций в генахSUP35 и SUP45 (по: Cox et al., 1988). В то же время, [PSI+] обладалцитоплазматическим характером наследования (по: Cox et al., 1988) и могтеряться как спонтанно (Cox et al., 1980; McCready et al., 1977), так и подвоздействием некоторых веществ, таких как хлорид гуанидина, метанол,этанол и некоторых других (Tuite et al., 1981).Позже были получены дополнительные подтверждения того, что [PSI+]является прионной формой белка Sup35.

Было показано, что в белок Sup35 в31цитоплазме клеток [PSI+] образует агрегаты. Также Sup35 формировал in vitroнеразветвленные фибриллы. Окончательное доказательство было получено в2006, когда удалось трансформировать клетки [psi-] фибриллами Sup35(Tanaka and Weissman, 2006). Трансформированные клетки приобреталифактор [PSI+].

Этот метод получил название «белковая трансформация» и былв последствии успешно применен для доказательства инфекционных свойствбелковых фибрилл других дрожжевых прионов (Saifitdinova et al., 2010; Tanakaand Weissman, 2006).Важным являлось открытие механизма поддержания фактора [PSI+].Было показано, что прион зависит от присутствия дрожжевого шаперонаHsp104 и элиминируется как при делеции гена HSP104, так и присверхпродукции белка Hsp104 (Chernoff et al., 1995).

Именно инактивациейHsp104 при пассировании клеток на среде с хлоридом гуанидина иобъяснилась потеря приона [PSI+]. На основании полученных данных былосделано предположение, что шаперон отвечает за фрагментацию фибриллSup35. При инактивации Hsp104 размер фибрилл увеличивается, и они немогут передаваться дочерним клеткам при делении.

При сверхпродукциишаперона, белок Hsp104 разбирает фибриллы до мономеров, а в мономернойформе белок утрачивает прионную конформацию (по: Kushnirov and TerAvanesyan, 1998). Позже было показано, что шаперон Hsp104 необходим дляподдержания большинства цитоплазматических дрожжевых прионов (по:Reidy and Masison, 2011).Белок Sup35 состоит из трех доменов, N, M и C, выполняющих разныефункции. С-терминальный домен белка имеет ГТФ-азную активность инеобходим для выполнения функции фактора терминации трансляции eRF3(Ter-Avanesyan et al., 1993). Функции М-домена однозначно не установлены,но, возможно, он выполняет роль шарнира между N- и С- доменами.

Такжебыло показано, что M-домен влияет на поддержание фактора [PSI+] (Liu et al.,2002). N-домен белка Sup35 (с 1 по 123 аминокислоту) вовлечен вспецифическуюдеградациюмРНК,связанную32сдеаденилированиемтранскриптов (translation termination-coupled mRNA decay) (Funakoshi et al.,2007; Hosoda et al., 2003) и связывание с фактором терминации трансляцииeRF1 (Sup45) (Urakov et al., 2006). Большую часть N-домена составляетприоногенный участок – последовательность, необходимая для поддержанияприонного состояния.

Ее особенностью является обогащенность остаткамиглутамина и аспарагина (Harrison and Gerstein, 2003). В прионном доменебелка Sup35 можно выделить два участка – участок, богатый аспарагином иглутамином (QN-богатый участок), и участок несовершенных повторов. QNбогатый участок, расположенный с 1 по 41 аминокислоту, необходим дляформирования фибрилл, в то время как несовершенные повторы важны дляподдержания приона (Osherovich et al., 2004).

Важно отметить, что богатыеаспарагином и глутамином прионные домены были обнаружены убольшинства известных дрожжевых прионов (по: Nizhnikov et al., 2016).Таким образом, прион [PSI+] является одним из первых дрожжевыхприонов, исследование которого способствовало развитию представлений оприонах и амилоидах в целом.2.3.3.2.1 Фактор [PIN+]Фактор [PIN+] был обнаружен в ходе изучения индукции приона [PSI+]de novo (Derkatch et al., 1997).

При сверхпродукции Sup35 в штаммах [psi-],полученных пассированием на среде с хлоридом гуанидина, [PSI+] невозникал, в отличие от штаммов [psi-], полученных в результате временнойсверхпродукции Hsp104. Было выдвинуто предположение, что для индукцииприона [PSI+] требуется наличие неизвестного приона [PIN+] (от [PSI+]inducibility), который изгоняется хлоридом гуанидина, но не сверхпродукциейHsp104 (Derkatch et al., 1997). В результате ряда исследований былоустановлено, что геном-детерминантом этого приона является RNQ1 (Derkatchet al., 2001; Sondheimer and Lindquist, 2000). Точная функция белка Rnq1 неустановлена. Сверхпродукция этого белка может подавлять вегетативный рост33(Yoshikawa et al., 2011), приводит к формированию восьмиасковых спор(Orlowska-Matuszewska and Wawrzycka, 2006) и летальности (Liu et al., 1992),при этом токсичность сверхпродукции усиливается в присутствии [PIN+](Douglas et al., 2008).