Диссертация (Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы), страница 7
Описание файла
Файл "Диссертация" внутри архива находится в папке "Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы". PDF-файл из архива "Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве СПбГУ. Не смотря на прямую связь этого архива с СПбГУ, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 7 страницы из PDF
Каталитические триады – широко распространенное явление,особенно среди гидролаз и трансфераз, обеспечивающих КОВАЛЕНТНЫЙКАТАЛИЗ,характернойособенностьюкоторогоявляетсяобразованиеКОВАЛЕНТНОГО промежуточного продукта, который затем гидролизуется,регенерируя фермент [43, 65]. Не только в случае альбумина, но и в случае"классических" сериновых гидролаз речь идет об АЦИЛИРОВАНИИ ипоследовательном образовании двух тетраэдрических структур, причем второйтетраэдр образуется при участии молекулы воды и трансацилировании ссеринового остатка на молекулу воды [164]. Даже один из наиболее быстрыхферментативных процессов - расщепление ацетилхолинэстеразой ацетилхолина(kcat/KM=1.6×108 М-1с-1 [181]), происходит по общей схеме (схема 5): стадияацилирования протекает по механизму присоединения–отщепления черезобразование стабильного тетраэдрического интермедиата. При нуклеофильнойатаке кислорода Ser203 фермента по карбонильному атому углерода субстратапроисходит протонирование His447, играющего роль основания в данномпроцессе.
Протонированный гистидин стабилизируется при взаимодействии сGlu334. В результате на стадии ацилирования происходит образование первоготетраэдрического интермедиата, стабилизированного водородными связями скислородами пептидных связей между остатками оксианионного центра(Gly121, Gly122, Ala204), который быстро распадается под действиемпротонированногогистидина,выступающеговкачествекислоты,доАЦИЛФЕРМЕНТА с выделением холина [208].
В первых же статьях сописанием механизма действия АХЭ был отмечен феномен субстратногоингибирования фермента, суть которого состоит в ингибировании стадииДЕАЦЕТИЛИРОВАНИЯ [92]. Так что ничего нового и удивительного в36образовании ковалентного аддукта (ацилфермента) нет, а вся проблемазаключается в «долговечности» ковалентной связи, которая зависит отструктуры и специализации активного центра, субстрата, рН и температуры.Безусловно, каталитической триады и оксианионного центра в том видекак они существуют в молекуле АХЭ, в молекуле альбумина нет, однако в рядеработ подчеркивается важная роль гуанидинового остатка соседнего Arg410 дляэстеразной активности альбумина в сайте Tyr411; полагают, что Arg410выполняетрольоксианионногоцентра,образуяводороднуюсвязьскарбонильной группой субстрата (рис.
1.11) [164], тогда как при связывании,напр., негидролизуемого диазепама Arg410 особой роли не играет [194].Рисунок 1.11. Гидролиз эфира с участием Tyr411 альбумина [164].Кроме того, для эстеразной активности альбумина (по крайней мере, поотношению к такому эфиру как п-нитрофенил 4-гуанидинобензоат) необходимостатокгистидина[114],т.к.рН-профильk2показалналичиедвухионизируемых каталитических групп в молекуле альбумина с рКа около 6 и 10,что свидетельствует об ионизации имидазольного остатка гистидина игидроксильной группы тирозина, соответственно.
Имидазольная группа37гистидина функционирует при гидролизе как общеосновной катализатор.Возможно, что для гидролиза альбумином некоторых субстратов необходимакаталитическая «диада» His-Tyr или Lys-Tyr, в которой гистидин или лизинвыполняют роль кислотного остатка; такие случаи описаны в литературе, с темотличием, что два разных гистидина выполняют функции кислотного иосновного остатков [68]. С учетом анализа этих и других литературных данных,можно предположить, что из двух главных сайтов, взаимодействующих с НФАи ФОС, сайт Садлоу I с Tyr150 проявляет "истинно" эстеразную активность, асайт Садлоу II с Tyr411 - псевдоэстеразную.
Такое разделение в достаточнойстепени условно; скорее всего, в обоих случаях имеет место образованиепромежуточного ковалентного аддукта, а отличия состоят во времени жизниэтого аддукта, т.е. разница состоит в константе k3, характеризующей реакциюдеацетилирования.1.7.
Субстратная специфичность альбумина.В одной из последних работ Краг-Хансена [113] собраны сведения о том,какой активностью обладает и аналогом каких ферментов является альбумин.Взяв за основу эти данные, мы составили модифицированный перечень,расширив библиографию и сделав акцент на фосфотриэстеразной активностиальбумина. Сначала – перечень активностей альбумина, связанных с редоксмодуляцией плазмы крови и межклеточной жидкости. Это тиоэстераза [13, 152],глутатион-зависимая тиол- или цистеин-пероксидаза [48, 95], пероксидазнаяактивность по отношению к гидроперекисям липидов [47, 95, 118, 119]; важноотметить участие в этом двух цистеинов альбумина, Cys392 и Cys438,образующих редокс-активный дисульфид в комплексе альбумина с пальмитоилКоА, в то время как Cys34 в этом виде активности участия не принимает.Альбумин является ловушкой радикалов благодаря шести метиониновымостаткам, но особенно за счет цистеина Cys34 [98, 163].
N-концевой участокальбумина человека Asp-Ala-His-Lys в комплексе с ионами меди обладаетвыраженной супероксид-дисмутазной активностью [28]. Альбумин можетстехиометрически инактивировать пероксид водорода и пероксинитрит за счет38обратимого окисления Cys34 до производного сульфеновой кислоты [157]. Кэтой группе активностей, наверно, можно отнести реакцию детоксикациицианида с образованием тиоцианата, катализируемая участками субдомена IIIA,но безучастия Tyr411 [101]. Наконец, здесь следует отметить ипрооксидантные свойства альбумина: связанные с альбумином ионы меди Cu 2+усиливают образование аскорбат-радикала, молекулярный кислород и протоныокисляют образовавшиеся при этом ионы Cu+ вновь до Cu2+ [86].Далее отметим простагландин D-синтазу и другие виды активности,связанные с метаболизмом простаноидов [73, 74, 109, 110, 195, 198, 200, 202].Еще более экзотические для альбумина активности - глюкуронидаза [67, 82,196] и енолаза [66, 134], хотя значение последней трудно переоценить в связи сдифференциальнойдиагностикойдоброкачественныхизлокачественныхопухолей.Далее – две группы активностей альбумина, с которыми связанонаибольшее количество исследований на протяжении десятков лет.
Перваягруппа - это карбоксилэстераза (КФ 3.1.1.1), арилэстераза (КФ 3.1.1.2),арилациламидаза (КФ 3.5.1.13) [131,133]. Следует особо отметить последнююизэтихтрехактивностейнитроацетанилидиальбумина,т.к.нао-нитротрифторацетанилид)двухсубстратахпоказано,что(оихгидролитическое расщепление происходит при участии Tyr411, при этом обапродукта реакции (о-нитроанилин и ацетат/трифторацетат) одновременновысвобождаются в среду без образования стабильного ковалентного аддукта сальбумином. В противоположность этому, ацетилсалицилат-деацетилазнаяактивность (КФ 3.1.1.55) [85] с большой вероятностью может оказатьсяисключительно псевдоэстеразной активностью [125].Втораягруппахарактеризуетфосфатазнуюактивность:этофосфомоноэстераза (КФ 3.1.3…?) [116], РНК-гидролаза или фосфодиэстераза(КФ 3.1.4.16 ?) [83], фосфотриэстераза (КФ 3.1.8.1 и 3.1.8.2) [121,176].
Кподподклассу 3.1.8 (гидролазы триэфиров фосфорной кислоты) относятсяарилдиалкилфосфатаза (КФ 3.1.8.1) и диизопропилфторфосфатаза (КФ 3.1.8.2)39[150, 169]. Арилдиалкилфосфатаза более известна под названием параоксоназа,среди других названий - А-эстераза, арилтрифосфатаза, эстераза В1, эстеразаЕ4, пиримифос-метилоксонэстераза, параоксон-гидролаза, арилтрифосфатдиалкилфосфогидролаза.Гидролизуетэфирытрехосновнойфосфорной,двухосновной фосфоновой и одноосновной фосфиновой кислот, характернойособенностью фермента является ингибирование хелатирующими агентами, т.к.для проявления активности необходимы дивалентные катионы (главнымобразом ионы Са2+) [8].
Карбарилаза (эстераза Е4), гидролизующая карбаматы,очевидно,такжеидентичнаарилдиалкилфосфатазе[63].Диизопропилфторфосфатаза (другие названия - ДФФаза, табуназа, зоманаза,органофосфат-ангидролаза,флуоридаза,органофосфат-ангидраза,диалкилфторфосфатаза,диизопропилфосфо-изопропилфосфорофлуоридаза,диизопропилфторфосфатдегалогеназа, диизопропилфторфосфатфторгидролаза).Действует на ангидридные связи фосфора (фосфор-галиды и фосфор-цианиды),в том числе в фосфорорганических отравляющих веществах (табун, зарин,зоман).
Так же как и арилдиалкилфосфатаза (КФ 3.1.8.1), требует для своейактивности двухвалентные катионы. Характерно, что этот номер присвоенферменту в 1992 г. на основании публикаций главным образом 1950-х годов, илишь одна из них - 1989 г. [23, 24, 25, 52, 146, 162]. Зависимость от ионов Са2+ иновыеданныелитературыпозволяютпредположить,чтодиизопропилфторфосфатаза и арилдиалкилфосфатаза суть один и тот жефермент, который привычнее называть параоксоназой (PON1) [26, 55].