Диссертация (Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы), страница 10

Аналогичный критерий былиспользован нами и для реакции альбумина с зоманом: в качестве кандидатов впродуктивные были отобраны только те фермент-лигандные комплексы, вкоторых атомы гидроксильного кислорода тирозина, атомы фтора и фосфоразомана лежали на одной прямой.2)фосфораРасстояние между гидроксильным атомом тирозина и атомомзомана(dist_O-P).Теоретическиерасчетыпоказывают,чтомаксимальное расстояние между гидроксильным кислородом и атакуемыматомом должно быть не больше 3,7 ангстрем [193].Погрешность(ламарковскийметода.генетическийПрименяемыйалгоритм)вданнойпозволяетработеподходисследоватьконформационное пространство лиганда внутри сайта связывания, егорезультатом является 50 (по заданному нами числу запусков) возможныхконформаций комплекса сайт-лиганд. Те конформации, разность RMSDкоторых не превышает 0.1нм, объединяются в кластер, то есть могут считатьсяодним и тем же энергетическим минимумом (можно считать, что с учетом52погрешности минимизации это одна и та же точка, в которую сходитсярешение).

В итоге результатом докинга является набор из нескольких (3-6)минимумов, то есть из нескольких наиболее вероятных конформаций. Вкаждом из этих минимумов сходится примерно 6-18 запусков минимизации, тоесть в каждом кластере, соответствующем одному минимуму, есть 6-18 близкихконформаций. Указывая константу ингибирования для найденной самойвыгодной конформации, мы использовали среднее арифметическое всехзначений, полученных в данном кластере. Максимальный разброс значений вкластере составил 7% от найденного среднего значения.53Глава 3.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ3.1. Предварительная оценка связывающей и эстеразной активностиальбумина.Вклад альбумина в гидролитическую активность плазмы крови.Известно, что альбумин обладает неспецифической эстеразной активностью вотношении субстратов – производных п-нитрофенола, которые обычноиспользуются для определения активности карбоксилэстеразы [140, 164, 186].Данных по активности альбумина по отношению к эфирам, которыеиспользуются в качестве субстратов для определения активности другихэстераз (АХЭ, БХЭ, НТЭ), в доступной литературе мы не нашли.

Дляпонимания возможного вклада альбумина в эстеразную активность сывороткикрови, а значит и его роли в возможном искажении данных, полученииложноотрицательных результатов при определении активности холинэстераз иНТЭ (а не только карбоксилэстеразы), мы провели модельный эксперимент, вкотором оценивали активность ЧСА относительно субстратов, которые обычноиспользуются для определения активности эстераз крови: НФА – дляопределения активности КЭ, фенилвалерат (ФВ) – для определения активностиНТЭ, ацетилтиохолин (АТХ) и бутирилтиохолин (БТХ) - для определенияактивности АХЭ и БХЭ, соответственно. Использовали ЧСА, концентрациякоторого в модельных растворах была взята исходя из содержания альбумина всыворотке человека.

Содержание альбумина в сыворотке определяли методом сбромкрезоловым зеленым на автоматическом биохимическом анализатореBiocode Hycel Lisa 300 Plus. Результаты одного из трех пилотныхэкспериментов с альбумином человека представлены в табл. 3.1. Видно, чтонаибольшая эстеразная активность альбумина, а также условный вклад вферментативную активность сыворотки наблюдается относительно гидролизаНФА и ФВ при сравнении с человеческой сывороткой.54Таблица 3.1.Значения активности ЧСА и сыворотки человека по исследуемым субстратамАктивность, мкмоль/мин×лИсследуемыйУсловный вкладсывороткасубстратв активность, %ЧСА, 42 мг/млчеловекаНФА651,42265,2141ФВ239,5936,2215АТХ2410,1032,311,3БТХ4803,5027,200,6ингибиторакарбоксилэстеразВлияниеспецифическогобис-4-нитрофенилфосфата (НФФ) на (псевдо)эстеразную активность альбумина.Далее мы исследовали насыщение БСА субстратом (НФА).

В качествеисследуемого образца был выбран БСА в концентрации 40 мг/мл (0,637мМ).Диапазон конечных концентраций субстрата: от 0,05 мМ до 0,5 мМ. Измерениеактивности по НФА проводили на планшетном спектрофотометре. В лункувносили 130 мкл буферного раствора, 20 мкл исследуемой пробы и 50 мклразведенного в 10 раз в буферном растворе субстрата. Субстрат предварительнорастворяли в этаноле. Измерения проводили на длине волны 405нм вкинетическом режиме (каждые 15 с) для проверки линейности накопленияпродукта. В обработку взята точка 12 мин.

Одновременно проведенэкспериментпоспецифическогопостроениюингибиторатакойжезависимостикарбоксилэстеразвприсутствиибис-4-нитрофенилфосфата(НФФ, 1мМ). Оба графика представлены на рисунке 3.1. 2,5мМ НФА являетсянасыщающей концентрацией для 0,637мМ БСА. При использовании 1 мМНФФ, насыщающая концентрация НФА стехиометрически снижается до 1,5мМ, что свидетельствует о взаимодействии НФФ исключительно с однимсайтом на альбумине.552.5BSA2.0BSA+NPP1.51.00.50.001234[S], mMРисунок 3.1. Активность БСА (0,637мМ) по НФА в зависимости отконцентрации субстрата (0,05-5 мМ) без ингибитора и с ингибитором НФФ(0,5мМ).Оценкасвязывающихиэстеразныхсвойствденатурированногоальбумина.

Известно, что альбумин денатурирует обратимо при температурахдо 74°С, и необратимо – при температуре выше 74°С. Для того чтобы выяснить,связана ли активность альбумина с целостностью его пространственнойструктуры, был проведен эксперимент по определению активности нативного иденатурированного БСА (1мг/мл). Исследовали 3 типа проб: белок при 37°С,белок при 76°С, и белок при 95°С. Денатурированный альбумин теряет своюНФА активность, причем одинаково при 76 и при 95°С (табл. 3.2).Таблица 3.2.Активность альбумина (БСА) по НФА при разных температурахТемпература,НФА-активность°Сальбумина, абс.370,025333760,009033950,009133Затем мы исследовали способность денатурированного альбуминасвязывать зоман. ЧСА в начальной концентрации 20 мг/мл был предварительноподвержен температурной денатурации инкубированием в течение 1 часа при5695°С.

На биохимическом анализаторе был измерен альбумин и общий белок впробах (табл.3.3).Таблица 3.3.Результаты измерения общего белка и альбумина в пробах с натуральным иденатурированным ЧСААльбумин при 37ºСАльбумин при 95ºСАльбумин,мг/мл17,07Общий белок,мг/мл16,7Альбумин,мг/мл15,32Общий белок,мг/мл16,2316,9721,3912,5520,9216,2421,8611,0923,5среднее16,7619,9812,9920,22ст. откл0,452,852,153,69Как видно из результатов измерения количество альбумина последенатурации снизилось, а количество общего белка осталось неизменным.

Этоможно объяснить тем, что методика по определению альбумина в раствореоснована на связывании альбумина с индикатором бромкрезоловым зеленым(БКЗ), в результате которого образуется окрашенный комплекс альбумин-БКЗ смаксимумом поглощения на 578нм. В то же время методика определенияобщего белка основана на взаимодействии ионов меди с пептидной связьюбелков в щелочной среде, что приводит к образованию окрашенного комплекса.По всей видимости, после денатурации способность альбумина связываться синдикатором БКЗ снизилась, что привело к снижению измеряемого количестваальбумина в пробе, в то время как количество пептидных связей и измеряемоеколичество общего белка не изменилось.

Таким образом, денатурированныйальбумин теряет способность связываться с индикатором бромкрезоловымзеленым (БКЗ) и детектируется как обычный белок.Вэкспериментепосвязываниюзоманаснативным(н.а.)иденатурированным альбумином (д.а.) использовали 5 типов проб: 1) зоман +буфер = контроль самопроизвольного распада зомана; 2) буфер + н.а. =57контроль влияния н.а. на активность АХЭ; 3) зоман + н.а. = опытная проба 1; 4)буфер + д.а. = контроль влияния д.а. на активность АХЭ; 5) зоман + д.а. =опытная проба 2.

Конечные концентрации: зоман 2х10-4мг/мл (1,1мкМ), ЧСА10мг/мл (145,6мкМ). Инкубировали при 37°С, через промежутки времени 10,120, 240 минут отбирали по 100мкл пробы, разводили в 2000 раз. ПолученныеобразцыанализировалипометодуЭллмана.Процентингибирования/активности в пробе без белка оценивали относительно«чистого»контроляАХЭ.Опытныепробыоценивалиотносительносоответствующего «грязного» контроля АХЭ (пробы 2 и 4). Результатыпредставлены на рисунках 3.2, 3.3 и в таблице 3.4.Рисунок 3.2. Динамика изменения % ингибирования АХЭ после инкубированиязомана с ЧСА и с буфером.58Рисунок 3.3. Оценка остаточной концентрации зомана по калибровке.Таблица 3.4.Оценка остаточной концентрации зомана по калибровкеколичество связанного зоманаВремя,денатурированныйнативныйминмг/млмкМмг/млмкМ105,57E-060,0314,99E-060,0271201,51E-060,0084,18E-050,2302409,63E-060,0533,70E-050,203Учитывая, что в растворе находилось 145,6 мкМ альбумина, можно заключить,что в среднем 1 М нативного альбумина «инактивирует» 1,49 мМ зомана, в товремя как 1 М денатурированного альбумина – 0,21 мМ зомана, т.е.