Диссертация (Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы)

Федеральное государственное унитарное предприятие"Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологиичеловека" Федерального медико-биологического агентства(ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России)На правах рукописиШМУРАКВладимир ИгоревичСРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СВЯЗЫВАЮЩЕЙ И ЭСТЕРАЗНОЙАКТИВНОСТИ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНАЧЕЛОВЕКА, БЫКА И КРЫСЫ03.01.04 - биохимияДиссертацияна соискание ученой степени кандидата биологических наукНаучный руководитель:доктор биол. наукН.В. ГончаровСанкт-Петербург, 2018 г.2СОДЕРЖАНИЕПеречень условных обозначенийВведениеГлава 1. Обзор литературы1.1.

Общая характеристика альбумина1.2. Эстеразная и псевдоэстеразная активность альбумина1.3. Фосфорорганические соединения (ФОС) и механизм ихтоксического действия1.4. Взаимодействие альбумина с ФОС1.5. Токсикокинетика и токсикодинамика зомана1.6. Сравнительный анализ эстеразной активности альбумина1.7. Субстратная специфичность альбумина1.8. Методы молекулярного моделированияГлава 2. Материалы и методыГлава 3. Результаты и обсуждение3.1 Предварительная оценка связывающей и эстеразной активностиальбумина.3.2. Сравнительное исследование связывающей и эстеразной активностиальбумина человека, быка и крысы с п-нитрофенилацетатом в качествесубстрата.3.3. Сравнительное исследование связывающей и эстеразной активностиальбуминов человека, быка и крысы с параоксоном в качестве субстрата.3.4.

Исследование связывающей и эстеразной активности альбумина сзоманом в качестве субстрата.3.5. Поиск сайтов, ответственных за эстеразную активность альбумина,методами молекулярного моделирования.3.6. Сравнительный анализ in silico связывания параоксона ссывороточным альбумином человека и быка.Глава 4. ЗаключениеВыводыСписок литературыстр.34111114151719243741465353587483881101211321343ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙАХ – ацетилхолинАХЭ –ацетилхолинэстеразаАТХ – ацетилтиохолинБСА – бычий сывороточный альбуминБТХ – бутирилтиохолинБХЭ – бутирилхолинэстеразаДМСО - диметилсульфоксидДТНБ – 5,5-дитио-бис-2-нитробензойная кислотаизо-ОМПА– тетраизопропил пирофосфорамидКЭ – карбоксилэстеразаНТЭ – нейротоксичная эстеразаНФА - п-нитрофенилацетатНФФ - бис-4-нитрофенилфосфатПМФК – пинаколинметилфосфоновая кислотаФБ – фосфатный буферФВ – фенилвалератФОВ – фосфорорганические отравляющие веществаФОС – фосфорорганические соединенияЧСА - сывороточный альбумин человека4ВВЕДЕНИЕАктуальность проблемы.В токсикологических и фармакологических исследованиях очень важнопонимать специфику видовых различий для адекватной интерпретацииполученных результатов при проведении доклинических и клиническихиспытаний, правильного расчета дозировок для человека.

Применительно кизучению фосфорорганических соединений (ФОС), одним из принципиальныхособенностей крови экспериментальных животных - крыс и мышей - являетсяналичие в ней карбоксилэстераз, тогда как в крови человека функциикарбоксилэстераз выполняет альбумин.Альбумин - это главный белок крови млекопитающих, где егоконцентрация составляет 500-700 мкМ. Молекула альбумина не покрытауглеводной оболочкой и может связывать самые разные молекулы и атомы:воду и катионы металлов (Са2+, Zn2+, Cu2+, Ni2+, Cd2+, Co2+, Pt2+, Au+), свободныежирныекислотыижирорастворимыегормоны,неконъюгированныйбилирубин, соли желчных кислот, трансферрин, окись азота, аспирин и другиесоединения [71].

Связывая лекарства и токсические вещества, альбумин взначительнойстепениопределяетихтранспортируяктканям-мишенямилифармакоместамиихтоксикокинетику,биотрансформации.Связывание происходит по двум первичным сайтам и нескольким вторичным,количество которых зависит от физико-химических свойств веществ исостояния молекулы альбумина. Так, для жирных кислот – основного лигандаальбумина – имеется 7 сайтов связывания, причем связавшиеся жирныекислоты изменяют полярность и объем сайтов связывания лекарственныхпрепаратов [84].

Наряду с липопротеинами, альбумин является одним изважнейших биомаркеров, определяющих повышенную вероятность летальногоисхода пациентов вне зависимости от пола, возраста и характера ихзаболевания [209, 210].Первые публикации, посвященные альбумину, появились в конце 19 в., атрехмерная структура альбумина сыворотки крови человека (ЧСA) была5исследована лишь в конце 20 в. Аналогичная структура бычьего сывороточногоальбумина (БСA) получена в 2012 г., а трехмерная структура крысиногоальбумина (КСA) не получена до сих пор.

Молекула сывороточного альбуминаобразована одной полипептидной цепью, состоящей из 585, 584 и 583аминокислотныхостатковдляальбуминачеловека,крысыибыка,соответственно [53, 129, 180]. Структура альбумина консервативна для всехмлекопитающих: молекула состоит из трех гомологичных доменов, каждый изкоторых состоит из десяти спиралей и может быть разделен на два субдомена,A и В, содержащих шесть и четыре спиралей, соответственно; эти двасубдомена соединены длинной петлей [42].

Молекула альбумина человека ибыка имеет 17 дисульфидных связей и один остаток цистеина со свободной SHгруппой [42, 84]. В первичной последовательности крысиного альбуминастолько же остатков цистеина, сколько в последовательности человека и быка,и они расположены в тех же позициях [179], поэтому есть все основанияпредполагать, что RSA также имеет 17 дисульфидных связей и один одиночныйцистеинвсвоейтрехмернойструктуре.Выравниваниепервичныхпоследовательностей аминокислотных остатков молекул ЧСA, КСA и БСA спомощью Clustal Omega [171] показало, что наибольшей идентичностьюобладают молекулы ЧСA и БСA – 75,6%. Однако процент идентичностипервичной структуры у молекул ЧСA и КСA составляет 73,0%, а у БСA и КСA— 69,9%.

Если же сравнить непосредственно аминокислотные остатки сайтаСадлоу I (сайт Садлоу II у всех трёх видов альбумина консервативен), то здесьуже молекулы ЧСA и КСA обладают наибольшей идентичностью – 75%, в товремя как БСA демонстрирует лишь 57% идентичность как с КСA, так и с ЧСA.Кроме того, у БСA преобладают замены лизиновых остатков на аргининовые всайте Садлоу I (Lys195→Arg195, Lys199→Arg199), что, вероятно, сказываетсяна его конфигурации, поскольку боковые цепи аргинина сильнее разветвлены.Трехмернаяструктураальбуминадостаточнолабильна,такчтопривзаимодействии с молекулой альбумина разных веществ имеют место такиеэффекты как кооперативность и аллостерическая модуляция, обычно присущие6мультимерным белкам [18]. Однако, в силу вышеуказанных различийпервичныхструктур,порезультатамисследованияфункциональныххарактеристик альбумина одного вида животных нельзя a priori утверждать,что альбумин другого вида будет обладать такими же характеристиками.Например, ЧСA при взаимодействии с жирными кислотами в растворе обладаетвысокой пластичностью и гибкостью, тогда как характеристики БСA в растворепо отношению к жирным кислотам не сильно отличаются от расчетных данных,полученных для его кристаллической структуры [161].В разные годы была показана эстеразная или псевдоэстеразнаяактивностьальбуминапоотношениюкα-нафтилацетатуиn-нитрофенилацетату (НФА), эфирам жирных кислот, аспирину, глюкуронидукетопрофена,циклофосфамиду,октаноилгрелину,эфирамнитроацетанилиду,никотиновойкислоты,нитротрифторацетанилиду,фосфорорганическим соединениям.

В токсикологии наибольший интереспредставляетпроблема(псевдо)эстеразнойактивностиальбуминапоотношению к ФОС (эфирам фосфорной кислоты) и особенно по отношению квысокотоксичным фосфорорганическим отравляющим веществам (ФОВ) –эфирам фосфоновой кислоты, к которым относятся зарин, зоман, V-газы.Установлено два сайта образования ковалентных аддуктов ФОВ с ЧСА - Tyr411и Tyr150 [103, 121]. Однако, несмотря на колоссальные возможностисовременных аналитических методов, имеющиеся данные не позволяютоднозначно решить проблему наличия или отсутствия у альбумина эстеразнойи других типов ферментативной активности.

До сих пор механизмывзаимодействия различных эфиров и других соединений с альбуминомостаются нераскрытыми, а межвидовые исследования вообще не проводились.В настоящее время доступна лишь одна работа, в которой применялись методымолекулярного моделирования для изучения процесса взаимодействия ФОВ(зомана) с альбумином [121]. При этом докинг проводили только в сайтесвязывания Tyr411. Метод молекулярной динамики [137, 211] в этой работе неприменялся.7Цель настоящей работы - биохимическими методами in vitro и методамимолекулярногомоделированияinsilicoисследоватьсвязывающуюиэстеразную активность сывороточного альбумина человека (Homo sapiens),быка (Bos taurus taurus) и крысы (Rattus norvegicus).Для достижения данной цели поставлены следующие задачи:1) определить биохимическими методами in vitro кинетические и равновесныехарактеристики взаимодействия ЧСA, БСA и КСA с п-нитрофенилацетатом;2) определить биохимическими методами in vitro кинетические и равновесныехарактеристики взаимодействия ЧСA, БСA и КСA с параоксоном;3) определить характеристики взаимодействия БСA с зоманом методами in vitroи in silico, установить сайты эстеразной активности альбумина;4)исследоватьспомощьюметодовмолекулярногомоделированиявзаимодействие параоксона с возможными сайтами связывания ЧСA и БСA.Положения диссертации, выносимые на защиту1) Предложена схема и математическая модель для описания каталитического истехиометрического взаимодействия альбумина с субстратами эстераз.2) Функциональные характеристики ЧСА и КСА отличаются между собой вменьшей степени по сравнению с функциональными характеристиками БСА.Более консервативными являются БСА по отношению к КСА и ЧСА, а такжесайт Садлоу II по отношению к сайту Садлоу I всех исследованных видовальбумина.3) Эффективность фосфорилирования сайта Садлоу II всех трех видовальбуминапривзаимодействииспараоксономвышеэффективностиацетилирования этого сайта при взаимодействии с п-нитрофенилацетатом.4) Исследование взаимодействия альбумина с зоманом методом остаточногоингибирования ацетилхолинэстеразы позволяет оценить аффинность к двумсайтам альбумина.5) Применение биохимических методов анализа в сочетании с методамимолекулярного моделирования позволяет определить сайты и характервзаимодействия эфирных субстратов с альбумином.8Научная новизна.Впервые в рамках одного исследования проведен сравнительный анализтрех видов альбумина (БСА, ЧСА, КСА) с использованием биохимическихметодов в сочетании с методами молекулярного моделирования (молекулярныйдокинг и молекулярная динамика).