Диссертация (Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы), страница 5
Описание файла
Файл "Диссертация" внутри архива находится в папке "Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы". PDF-файл из архива "Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве СПбГУ. Не смотря на прямую связь этого архива с СПбГУ, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 5 страницы из PDF
[46]. Исследуя кинетику гидролиза НФА, они установили, что оба продуктареакции - ацетат и п-нитрофенол - высвобождаются в соотношении, близком к1:1, а после полного гидролиза одной порции НФА ферментативная активностьальбумина не только не исчезает, но даже не уменьшается при добавленииследующей порции. Они также указали на то, что кинетика реакции гидролизаэфиров альбумином соответствует кинетике Михаэлиса-Ментен с образованиемпромежуточного комплекса [142]. Кроме того, они установили, что кажущаясяконстантадиссоциациикомплекса[альбумин]-[п-нитрофенил-N-метилкарбамат] равна 1,4×10-4 М, подчеркивая, что эта величина соответствуетвеличине Ks многих других эстераз [46].Однако первая публикация, в которой было обосновано существование вмолекуле альбумина по меньшей мере двух разных центров (сайтов),отвечающихзадвавидаактивности,-"истинно"эстеразнуюипсевдоэстеразную, - появилась в 1972 г. [186].
Взаимодействие альбумина сНФА имеет двухфазный характер: в течение первых минут наблюдается"всплеск" (burst) активности, т.е. происходит быстрое образование продукта,после чего система переходит в стационарный режим, но не выходит на плато.Первуюфазуобеспечиваютдвапроцессавдвухразныхсайтах:моноацетилирование альбумина в результате псевдоэстеразной активностиодного сайта и альбумин-катализируемый «истинный» гидролиз во второмсайте. Вторая стадия обусловлена активностью только второго сайта. Эти двефазы легко воспроизводятся, ингибиторный анализ первой фазы с применением26НФА в качестве субстрата был использован в работе Zaidi с соавт.
в 2013 г.[205]. В работе [186] также было показано, что при гидролизе НФА происходитацетилирование двух тирозинов, однако ацетилирование второго тирозина немешаеткаталитическойактивностиальбумина.Авторыисследованияпредложили рабочую модель, согласно которой ацетилирование второготирозина происходит рядом с сайтом, ответственным за катализ, и после тогокак второй тирозин становится ацетилированным, ацетатная группа переходитсразу на молекулу воды.Проблемы идентификации и классификации эстераз неоднократнообсуждались биохимиками, особенно в 1970-80х годах [105, 191]. Пожалуй, какникакая другая группа ферментов эстеразы имеют широкую субстратнуюспецифичность.
С другой стороны, одну и ту же эстеразную реакцию могуткатализировать различные ферменты, порой относящиеся к другим классамферментов, либо не относящиеся вообще ни к какому классу (тот же альбумин).При обсуждении специфичности эстераз возникает, в частности, вопрос: каковадолжная быть гидролитическая активность фермента, для того чтобы его можнобыло причислить к "истинным" эстеразам? Например, α-химотрипсин иальдегиддегидрогеназа могут гидролизовать НФА со скоростью (числооборотов kcat) 0,9 и 54, соответственно, однако это безусловно очень мало посравнению с карбоксилэстеразой печени, гидролизующей НФА со скоростью41000 оборотов [105]; к тому же у них есть "родные" субстраты, с которыми ониработают намного эффективнее.
Было предложено считать истинной эстеразойфермент, каталитическая активность которого составляет «тысячи оборотов»,но определенная величина так и не была принята в качестве критерия [191]. Нестоит, однако, забывать о том, что классическая кинетика Михаэлиса-Ментен иБриггса-Холдейна [39, 142] предполагает: 1) избыток свободного субстрата, 2)стационарность (d[ES]/dt=0), и 3) быстрое установление равновесия междуферментом и субстратом, что возможно при kcat<<k-1 и kcat≤k+1, т.е.
когдазначения Km и Ks практически совпадают. Ситуации, когда kcat>>k-1 и/или k+1, иликогда мы не знаем a priori сколько свободного субстрата имеется в27стационарном состоянии (что часто наблюдается при работе с «настоящими»ферментами с большим числом оборотов), означает серьезное отклонение отклассической кинетики и требует применения других моделей, напр. ванСлайка-Каллена или Моррисона [75, 115, 145].
Много ли мы знаем примеровприменения этих более адекватных моделей? Вопрос риторический, но намважно понимать, что кинетика взаимодействия альбумина с некоторымисубстратами куда более соответствует классической ферментативной кинетике,чем кинетика «настоящих» ферментов.60 лет назад было предложено разделить эстеразы на две группы, А и В[14, 15]. Согласно Aldridge, В-эстеразы ингибируются ФОС, карбаматами исероорганическими соединениями, тогда как А-эстеразы не только неингибируются ФОС, но гидролизуют их. Характерной особенностью В-эстеразявляется наличие серина в активном центре, поэтому их еще называютсериновыми эстеразами.
А-эстеразы не столь хорошо изучены, но многие изних чувствительны к агентам, связывающим сульфгидрильные группы, поэтомуих предлагали называть "цистеиновые эстеразы" [105]. Кстати, по формальнымпризнакам альбумин можно отнести к этой группе цистеиновых А-эстераз. Впользу этого свидетельствуют данные, полученные относительно недавно, омодуляции (псевдо)эстеразной активности альбумина малоновым диальдегидоми пероксидом линоленовой кислоты [183].Рисунок 1.6. Схема взаимодействия между эстеразой и эфиром [105].Рисунок 1.7. Схема взаимодействия между альбумином и НФА [20].28Рисунок 1.8.
Спонтанный и альбумин-катализируемый гидролиз пнитрофениловых эфиров [164].Рисунок 1.9. Спонтанный и альбумин-катализируемый гидролиз зомана [121].Рисунок 1.10. Схема взаимодействия между ацетилхолинэстеразой иацетилхолином: полная (1-3) и упрощенная (4a,b) [207].Юнг и Криш отмечали в 1973 г., что с теоретической точки зрения оченьтрудно провести четкую границу между эстеразами, чувствительными к ФОС, иэстеразами,гидролизующимиФОС,т.к.некоторыеВ-эстеразымогутгидролизовать некоторые ФОС (напр., параоксон) [105]. Но главное заключениеэтих авторов состоит в следующем: существует одна принципиальная схемареакции между эстеразой и эфиром (рис.
1.6-1.10), а считать тот или иной эфирсубстратом или ингибитором эстеразы (применительно к нашей проблеме считать фермент "истинной" эстеразой или псевдоэстеразой) - зависит от29соотношенияскоростейобразованияигидролитическогорасщепленияковалентного комплекса (аддукта). Что же касается проблем эстеразнойактивности и возможной классификации альбумина, мы полагаем, что ихследует рассматривать не с точки зрения особенностей А и В-эстераз, а с точкизрения существования у альбумина нескольких центров связывания/активностисразличнымзначениемкинетическихконстант.Так,гидролиз4-нитрофенилмиристата авторы работы [21] считают псевдоферментативнымгидролизом, т.к. константа скорости деацилирования сайта Tyr411 k+3<<k+2(k+3~10-5сек-1, k+2~0,4сек-1); другие сайты не были исследованы.
Сравнительныйанализ активности альбумина по отношению к пара- и орто-нитрофениловымэфирам с различными боковыми цепями в качестве субстратов показал, чтонаиболее «подходящим» субстратом, свидетельствующим о наличии уальбумина эстеразной активности, является п-нитрофенилпропионат: kcat=0,166s-1, Кs=1,55×10-4 M, kcat/Кs=1079 M-1s-1 [164].
И опять в центре внимания одинлишь Tyr411. Здесь необходимо отметить вроде бы очевидный факт, которыйостается за скобками и не обсуждается в подавляющем большинстве работ: длялюбого сайта альбумина собственно первой стадией является образование нековалентного аддукта, а промежуточного комплекса, известного как комплексМихаэлиса. Определить константы k+1 и k-1 для каждого отдельно взятого сайтаальбуминапрактическиневозможно,такчтозаслуживаетвниманияэкспериментальная оценка самой первой стадии взаимодействия альбумина сНФА (образование некоего "обобщенного" фермент-субстратного комплекса,исходного квазиравновесного состояния, для достижения которого требуетсяменее чем 1,1 мсек).
Были получены следующие кинетические характеристики:k+1≥6,8×106 М-1×с-1; k-1≥3,5×103 с-1; Ks=(4,7±0,5)×10-4 M [20]. Для полнотыкартины укажем другие константы, приведенные в этой статье, но относящиесяуже к конкретному сайту Tyr411: k+2=(4,2±0,4) ×10-1 с-1; k+2/Ks=(8,9±0,9)*102 М1×с-1 (22oC, pH=7,5).
Взяв недостающую константу k+3=3,2×10-6 с-1 (при рН=8,0)из работы [126], авторы вычисляют константу Михаэлиса: Km = (Ks×k+3)/(k+2+k+3)~ 3×10-9 M (!) [20]. Вот какие удивительные «открытия» можно сделать, если30одному Tyr411 «приписать» параметры обобщенного равновесного состояниявсех сайтов молекулы альбумина, взаимодействующих с НФА (или другимсубстратом). Общее количество этих сайтов может достигать 82, если брать врасчет все сайты, которые ацетилируются при сверхдлительной инкубацииальбумина со сверхнасыщающими концентрациями НФА [126]. Продолжимвычисления:выявленныеk+3/Км=1×103.приДлясравненияисследовании-аналогичныевзаимодействияпараметры,ацетилхолинасацетилхолинэстеразой (АХЭ): k1=6,7×104 М-1×с-1, k-1=87,7 с-1, kcat=44,6 с-1 [207].На основании этих данных Км~2×10-3. С ацетилтиохолином в качествесубстрата Км=8×10-4 (k1=20,4×104 М-1×с-1, k-1=52,0 с-1, kcat=12,8 с-1).
Определимкаталитическую эффективность: kkat/Км=2×104. Отличия от справочных данных(Км=9×10-5,kcat/Км=1,6×108[181])обусловлены,очевидно,условиямипроведения эксперимента (25оC, pH=8, ионная сила 0,11 M), но ведь и сальбумином данные получены в не совсем физиологических условиях. Cравнимеще с лизоцимом, которого с альбумином объединяет отсутствие заметныхотличий между Km и Ks: kcat=0,15 c-1, Km равно Ks с максимальным значением9×10-6 M при pH5, отсюда kcat/Km=1,7×104 [27]. После этого трудно утверждать,что кинетические характеристики альбумина как фермента радикальноотличаются от характеристик "классических" ферментов.Безусловно, нельзя не учитывать тот факт, что альбумин гидролизует теили иные субстраты с не очень высокой скоростью, но при этом надо учитыватьи другой факт: в плазме крови человека (в отличие от плазмы крови грызунов изайцеобразных) нет карбоксилэстераз, осуществляющих этот гидролиз болееэффективно [122].
Количество "неразборчивой" (promiscuous, т.е. с широкойсубстратной специфичностью) параоксоназы-1 (PON1) в плазме крови человекапримерно на 3 порядка меньше количества альбумина (по массе), да икинетические характеристики PON1 по отношению к высокотоксичным ФОС(зоман и ряд других) не позволяют всерьез рассматривать этот фермент каксредство их детоксикации при токсикологически релевантных концентрациях идозах. В то же время, учитывая огромное количество альбумина в плазме крови31и принимая во внимание равновесный характер взаимодействия многихсубстратов с альбумином (k-1˃˃k+2) [21], кажущаяся константа скорости реакциипсевдопервого порядка может оказаться не столь маленькой с точки зренияфизиологической,аименноэтотприкладнойаспектявляетсяосновополагающим в наших исследованиях.