Диссертация (Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы), страница 3
Описание файла
Файл "Диссертация" внутри архива находится в папке "Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы". PDF-файл из архива "Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве СПбГУ. Не смотря на прямую связь этого архива с СПбГУ, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 3 страницы из PDF
В многочисленныхэкспериментах была показана эстеразная или псевдоэстеразная активностьальбумина по отношению к α-нафтилацетату и n-нитрофенилацетату (НФA)[46, 140, 186], эфирам жирных кислот [187], аспирину [159], глюкуронидукетопрофена [67], циклофосфамиду [116], эфирам никотиновой кислоты [165],октаноилгрелину [62], нитроацетанилиду [131], нитротрифторацетанилидуТакже[133].былапродемонстрирована(псевдо)эстеразнаяактивностьальбумина по отношению к некоторым ФОС, в т.ч. высокотоксичным: тиофос,параоксон [130, 147], зоман, зарин [38], циклозарин, табун и RVX [103, 197].Ацетилирование – характерный пример псевдоэстеразной активностиальбумина (реакция псевдопервого порядка), когда убыль эфирного субстратаобусловлена не его гидролизом, а образованием им ковалентных связей помногим аминокислотным остаткам (сайтам) молекулы альбумина. Установлено,что ацетилирование альбумина НФA может идти по 82 а.о.
(сайтам), из них 59а.о. лизина, 10 - серина, 8 - треонина, 4 - тирозина и 1 –аспартата [126]. НФAпроявляет наибольшее сродство к Tyr411, однако аддукты, ацетилированные поостаткам лизина, более стабильны.Втоксикологии(псевдо)эстеразнойнаибольшийактивностиинтересальбуминапредставляетпопроблемаотношениюк15фосфорорганическимсоединениям(ФОС)-эфирамфосфорнойилифосфоновой кислот. Установлены сайты образования ковалентных аддуктовФОВ с альбумином - Tyr411 и Tyr150 [103, 121]. Помимо (псевдо)эстеразнойактивности, альбумин проявляет пероксидазную активность по отношению кгидроперекисям липидов [49, 95, 118] и ряд других активностей.
Несмотря наочевидные успехи современных аналитических методов и стремлениенекоторых ученых доказать с помощью этих методов отсутствие у альбуминаистинно эстеразной и других типов ферментативной активности, полученныерезультаты не позволяют однозначно решить проблему. До сих пор механизмывзаимодействия различных эфиров и других соединений с альбуминомостаются нераскрытыми.1.3.Фосфорорганическиесоединения(ФОС)имеханизмихтоксического действия.ФОС по своей химической природе являются триэфирами фосфорной илитиофосфорной кислоты.
Для всех ФОС характерно наличие атома фосфора,связанного двойной связью с атомом серы или кислорода (рис.1.2).Рисунок 1.2. Общая схема ФОС. R – алкильный радикал, Х - «уходящая»группа.Механизм действия ФОС обусловлен ингибированием различных эстеразорганизма, а особенно эстераз в составе нервной системы. Классическимпредставлением реакции ФОС с белками является нуклеофильная атака насериновые гидроксильные группы в активном центре сериновых протеаз [148].Результатом такой реакции является инактивированная протеаза, ковалентносвязанная с ФОС. Общий механизм энзиматической активности сериновыхэстераз представлен на рисунке 1.3а.16Рисунок 1.3. Реакция сериновой эстеразы с карбоксилэфиром и с ФОСингибитором. Активный сериновый остаток в активном центре ферментапредставлен в виде ОН.
а) Взаимодействие фермента с субстратом за счетнуклеофильной атаки ацильного углерода эфира. б) Взаимодействиефермента с ФОС по аналогичному механизму.Кислород в составе гидроксильной группы серинового остатка вактивномцентреферментаосуществляетнуклеофильнуюатакунакарбонильный атом углерода субстрата. Это приводит к формированиюковалентного ацил-ферментного интермедиата и высвобождению спиртовогомотивасубстрата.Нуклеофильнаяперестановкаацильнойгруппынагидроксильную группу воды приводит к освобождению фермента и окончаниюкаталитического цикла. ФОС реагируют с ферментом аналогично, что приводитк формированию ковалентного интермедиата с высвобождением «уходящей»группы Х.
Скорость гидролиза фосфорилированного фермента намного нижескорости связывания ацил-ферментного комплекса. Таким образом, ферментостается постоянно заингибированным. Кроме того, фосфорилированныйфермент может последовательно подвергаться второй реакции, называемойстарением, связанной с потерей одного из радикалов R в составе молекулыФОС. Это приводит к тому, что активный сайт фермента оказываетсяковалентно связан с отрицательно заряженным моно-органофосфатным17мотивом, который более устойчив к удалению нуклеофилами. Скоростьстарения фосфорилированного фермента зависит от природы радикала R иявляется наиболее низкой для метильного радикала [7].
Только те ФОС, вкоторых атом фосфора взаимодействует двойной связью с атомом кислорода(Р=О), а не серы, могут взаимодействовать с эстеразами. Такие широкоиспользуемые ФОС как диазинон или хлорпирифос, которые содержат атомфосфора, связанный двойной связью с атомом серы, должны сначала пройти впечени биоактивацию до своих кислородных аналогов (диазоксон илихлорпирифос оксон) посредством цитохрома Р-450. Следует отметить, что этаже система принимает участие в метаболической детоксикации ФОС.
ФОСтакже могут быть инактивированы путем конъюгации с глутатионом или могутбыть гидролизованы некоторыми эстеразами, такими как карбоксилэстераза ипараоксоназа.1.4. Взаимодействие альбумина с ФОС.Известно, что основными ферментами, участвующими в детоксикацииФОС и карбаматов, являются фосфотриэстеразы, к которым относитсяпараоксоназа-1 (ПОН-1), а также предположительно карбоксилэстеразы иальбумин [174, 190]. Альбумин, в отличие от ПОН-1, обладает ЭДТАустойчивой эстеразной активностью по отношению к ФОС и карбаматам.Сначала было установлено, что альбумин способен связывать эти соединения[130, 147, 172], затем было показано, что альбумин может реагировать с ними[38].
Установлено, чтоФОС инекоторые карбаматыгидролизуютсяальбумином путем кратковременного фосфилирования/алкилирования егоактивного сайта [57, 121, 174, 175]. Считается, что центральное место привзаимодействии занимает тирозиновый аминокислотный остаток, а именноTyr411. Его высокая нуклеофильная способность по сравнению с остальнымитирозиновыми аминокислотными остатками, находящимися на поверхностимолекулы альбумина, обусловлено влиянием Arg410 [194].
Arg410 находится внепосредственной близости к фенольному кислороду Tyr411, что приводит кповышению его нуклеофильной активности. Функциональная значимость18Tyr411 и Arg410 подчеркивается их высокой консервативностью в альбуминахмлекопитающих [112].По нарастанию продуктов в ходе реакций гидролитического расщепленияФОС и карбарила альбумином группой исследователей были рассчитаныкинетические константы, представленные в таблице 1.1 [177] Авторы работыподчеркивают, что в ходе расчетов они не учитывали возможностьнеобратимого связывания субстрата с альбумином, то есть образованиеаддукта.
В работе продемонстрировано, что альбумин играет важную роль вдетоксикации параоксона и карбарила и в меньшей степени в детоксикациихлорпирифосоксона. Значение кажущейся Km, рассчитанной для БСА, равно0,41 мМ для хлорпирифосоксона, 1,85 мМ для параоксона [184] и 3,6 мМ дляДФФ в случае альбумина человека [141].Таблица 1.1.Характеристики ферментативного гидролиза ФОС и карбаматов альбумином[177]Каталитическая-1Ферментсубстратkcat (мин )Km (мкМ)эффективностьkcat/Km (M-1×мин-1)ЧСАпараоксон1,5×10-33773,9ЧСАхлорпирифосоксон4,0×10-2264015БСАкарбарил9,9×10-338026ФОСспособныковалентномодифицироватьальбумин,тоестьобразовывать аддукты.
С помощью МАЛДИ масс-спектрометрии былиполучены прямые доказательства того, что хлорпирифосоксон, дихлорфос,ДФФ и зарин ковалентно связываются с Tyr 411 альбумина человека [123].Впоследствии была показана роль Tyr411 в образовании аддукта с зоманом[121]. В отличие от аддуктов зомана с холинэстеразами, аддукт зомана сальбумином практически не подвергается процессу старения, то есть не теряетпинаколиловую цепочку (заместитель) [103, 124]. Кроме того, аддуктыальбумина устойчивы к терапии оксимами [197], поэтому имеются основания19для их использования аддуктов альбумина с ФОВ в качестве маркеровотравления.1.5. Токсикокинетика и токсикодинамика зомана.Зоман (О-пинаколилметилфторфосфонат, GD) вместе с табуном (GA),зарином (GB) и циклозарином (GF) по своему химическому строению ивысокотоксическим свойствам объединены в группу G-газов.
Молекула зоманаимеет два хиральных центра: атом углерода и атом фосфора. Следовательно,существует четыре стереоизомера зомана (рисунок 1.3). Синтетический зоманпредставляет собой смесь четырех стереоизомеров и обозначается как С(±)Р(±)зоман, в то время как отдельные стереоизомеры обозначают как С(+)Р(+),С(+)Р(-), С(-)Р(+), С(-)Р(-).
Атом углерода (С) отвечает за хиральность впинаколиловом заместителе, а атом фосфора (Р) – за хиральность вокруг атомафосфора в молекуле зомана. Пары энантиомеров зомана (С(+)Р(+) и С(-)Р(-);С(+)Р(-) и С(-)Р(+)) представлены в синтетическом С(±)Р(±) зомане всоотношении 45:55, с эквивалентным количеством двух энантиомеров внутрикаждой пары [178]. В последнее время применяют новые обозначенияконфигурацийстереоизомеров:старыеобозначениярасположенийзаместителей относительно хиральных центров Р-, Р+, С+ и С- соответствуютобозначениям PS, PR, CS и CR.Рисунок 1.3.
Стереоизомеры зомана [151]Известно,параметрамичтостереоизомерытоксичности.зоманаТоксичностьхарактеризуютсяразличныхразнымистереоизомеров20коррелирует с их ингибирующей активностью по отношению к АХЭ, главноймишени всех ФОВ. Величины LD50 для мышей и бимолекулярные константыскорости ингибирования АХЭ разными стереоизомерами приведены в таблице1.2 [151].Константы скоростей ингибирования АХЭ вычисленные для Р(-)стереоизомеров зомана как минимум на пять порядков выше по сравнению стеми же величинами для Р(+) стереоизомеров.