Диссертация (Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы), страница 4

Точное значение константскоростей ингибирования АХЭ для Р(+) стереоизомеров вычислить нельзя из-заприсутствия в них небольших количеств Р(-) стереоизомеров. Как и следовалоожидать, Р(-) стереоизомеры зомана характеризуются параметрами остройтоксичности, которые по крайней мере на два порядка выше аналогичныхвеличин для Р(+) стереоизомеров. Таким образом, принимая во вниманиеэксперименты in vitro и in vivo можно заключить, что Р(+) стереоизомерыявляются нетоксичной примесью синтетического С(±)Р(±) зомана.Таблица 1.2.Стереоселективность стереоизомеров зомана по отношению к АХЭ ипараметрам острой токсичности.КонстантаКонстантаLD50 для мышейскоростискорости(мкг/кг)СтереоизомерфосфонилированияингибированияАХЭ человекаАХЭ (М-1 ×мин-1)(М-1 ×мин-1)С(+)Р(-)2,8×10899 (п/к)15000±30008С(-)Р(-)1,8×1038 (п/к)8000±4003С(+)Р(+)<5×10>5000 (п/к)0,2±0,13С(-)Р(+)<5×10>2000 (в/в)0,2±0,1С(±)Р(±)156 (п/к)Benschop с сотр.

для проведения токсикокинетических исследованийиспользовали анестезированных крыс (барбитал натрия/гексобарбитал натрия)с искусственной вентиляцией легких. Непосредственно перед введением зоманакрысамвнутрибрюшиннотоксикокинетическиевводиликривыеатропин.лучшеУстановлено,всегочтоописываютсятрехэкспоненциальными зависимостями [32]. представленными на рисунках 1.4и 1.521КоличествоотносительнонетоксичногостереоизомераС(+)Р(+)невозможно обнаружить в крови отравленных животных даже в первой порциикрови, которую отбирали через 0,3 мин после введения агента. С(-)Р(+)стереоизомероказалсяболеестабильным.Егоприсутствиевкровиотравленных животных наблюдали вплоть до 4 минуты после введения агента.БыстроеснижениеконцентрацииотносительнонетоксичныхС(±)Р(+)стереоизомеров в большей степени объясняется их быстрым ферментативнымгидролизом и ковалентным связыванием с белками плазмы.

Интересно, что вотличие от относительно нетоксичных стереоизомеров токсичные С(±)Р(-)стереоизомеры зомана наблюдали в крови отравленных животных в течениенескольких часов в зависимости от введенной дозы агента.Рисунок 1.4. Снижение концентрации Рисунок 1.5. Снижение концентрациитоксичных изомеров зомана в плазме токсичных изомеров зомана в плазмекрыс в течение 30 минут послекрыс в течение 30 минут послевведения зомана в дозе 1LD50введения зомана в дозе 3LD50Существуют несколько путей удаления зомана из организма: спонтанныйгидролиз,ферментативныйгидролиз,ковалентноесвязываниесбиологическими мишенями (макромолекулами), выведение с мочой.

В 1946году Mazur описал явление усиление гидролиза фосфорофлуоридатов вприсутствииплазмычеловекаикролика,измеряяобразованиедиалкилфосфорных кислот и ионов фтора [136]. Считается, что гидролизфосфофлуоридатоввплазмеитканяхмлекопитающихпроисходитисключительно через разрыв Р-F связи (связи между фосфором и фтором).Стереоселективность ферментативного гидролиза зомана довольно хорошо22изучена [56, 57, 59, 60]. В различных тканях разных видов С(±)Р(+)стереоизомеры зомана гораздо быстрее гидролизуются фосфорилфосфатазамипосравнениюсболеетоксичнымиС(±)Р(-)стереоизомерами.Ориентировочные скорости гидролиза различных стереоизомеров зоманаприведены в таблице 1.3.Таблица 1.3.Константы скорости первого порядка гидролиза стереоизомеров зомана,полученные для разбавленных гомогенатов печени и плазмы крыс, морскихсвинок, мартышек и разбавленной плазмы человека (рН 7.5, 37°С)Константа скорости (10-3 M-1×мин-1)ИсточникС(+)Р(-)С(-)Р(-)С(-)Р(+)С(+)Р(+)Плазмачеловек0,73,2480860мартышка1,25,53101200морская свинка0,20,880220крыса1,53,212003400мартышка1,01,940900,91,62705102,84,44202500Печень морская свинкакрысаСкорости гидролиза соотносятся между собой следующим образом:С(+)Р(+) >> С(-)Р(+) >> С(-)Р(-) ≥ С(+)Р(-) [60].

Данные представленные втаблице свидетельствуют о том, что ферментативный гидролиз токсичныхстереоизомеров зомана в различных тканях крыс, морских свинок, мартышек ичеловека довольно незначительный или вообще отсутствует. Очевидно, чтовеличины скоростей гидролиза С(±)Р(-) стереоизомеров зависят от того, какаяткань была использована в качестве ферментативной составляющей анализа,поскольку скорости гидролиза в органах-мишенях (мозг, мышцы) ниже просравнению с остальными органами.Следующим путем удаления зомана из организма является егоковалентное связывание с биологическими мишенями.

Было показано, чтореакция ФОС с карбоксилэстеразами является важным путем их детоксикацииin vivo. Чем больше у вида КЭ, тем выше значение LD50. Альбумин также23способен ковалентно связываться с ФОС преимущественно по тирозиновымаминокислотным остаткам. Количество активных сайтов АХЭ и БХЭсоставляет совсем небольшой процент от общего количества сайтовсвязывания, рассчитанного для крыс [135]. Следовательно, связывание зомана схолинэстерзами имеет лишь незначительное влияние на токсикокинетикуфосфонофлуоридатов, несмотря на то что связывание зомана с АХЭ являетсяключевым событием с точки зрения токсикологии.Сравнивая количества зомана, связанные различными тканями крыс,морских свинок и мартышек через 1 час после введения дозы 6 LD50С(±)Р(±)С14 зомана, с количествами зомана, связанного в опытах in vitro плазмой итканевыми гомогенатами после их инкубации с избытком зомана, можнозаключить, что в тканях in vivo не происходит занятие зоманом всех сайтовсвязывания даже при очень большом количестве зомана, за исключением, бытьможет, плазмы и тканей легкого, которые первыми подвергаются действиюзомана при внутривенном введении.

Этот вывод согласуется с наблюдениямиMaxwell с сотр. [135], которые подсчитали, что общее количество КЭ ворганизме крысы способно связать более 14 LD50 зомана.Установлено, что токсичные С(±)Р(-) стереоизомеры зомана быстроковалентно связываются с различными биологическими мишенями, в то времякакменеетоксичныеизбирательномуС(±)Р(+)ферментативномустереоизомерыгидролизу.зоманаАХЭ,подвергаютсявыделеннаяизэритроцитов и из мозга человека преимущественно ингибируется С(±)Р(-)стереоизомерами зомана [61].

Таким образом, можно предположить, чтоС(±)Р(-)стереоизомерызоманапреимущественноудаляютсяпутемковалентного связывания, а С(±)Р(+) – путем ферментативного гидролиза.Вследствие очень быстрого процесса деградации только небольшие количестваС(±)Р(±) зомана выводятся через почки. Lenz с сотр. показали, что более 99%выведенных с почками изотопных соединений были получены в ходе гидролиза1 LD50 С(±)Р(±)-С14 зомана в течение 1 часа после его введения крысам [120].24Стереоселективность альбумина по отношению к зоману носит спорныйхарактер.

С помощью программ ковалентного докинга иустановленоотсутствиестереоизомернойселективности31Р ЯМР былоальбуминапоотношению к зоману [121]. Этот факт противоречит данным полученнымхроматографическимиметодами.ВсвоейработеYeungссотр.продемонстрировали, что ЧСА преимущественно связывается с менеетоксичными Р(+) энантиомерами зомана, в то время как БХЭ человекасвязывает более токсичные Р(-) энантиомеры зомана [203]. В работе былииспользованы эквимолярные или близкие к ним соотношения альбумина изомана.1.6. Сравнительный анализ эстеразной активности альбумина.Ферменты снижают энергию активации, как известно, двумя способами[181]: 1) снижая свободную энергию переходного состояния в результате егочеткой пространственной фиксации, 2) изменяя путь реакции от субстрата допродукта, например, делая его многоступенчатым, с образованием рядапромежуточных продуктов.

Вероятно, альбумину присущи оба способаферментативной активности, но даже если бы альбумин осуществлял гидролизэфиров исключительно вторым способом, имеются все основания считать егоферментом. Механизм трехстадийной ферментативной реакции с образованиемковалентного аддукта в качестве промежуточного продукта реакции описаннастолько давно, что уже давно вошел в классические учебники по энзимологии(см., напр., «Ферменты» Диксона и Уэбба, 1982). Константа k2 становитсяконстантой образования ковалентного аддукта (напр., ацилфермента), акинетическая константа k3 (она же kcat), как правило, характеризуетлимитирующую стадию ферментативной реакции, т.е.

перехода ацильнойгруппы с молекулы белка на молекулу воды (схемы 1-5) [20, 21, 105, 121, 164].Скорости ацилирования и деацилирования для разных субстратов варьируют вочень широких пределах, и было немало разговоров о той границе, начиная скоторой можно говорить об «истинном» катализе (эстеразная активность), вотличие от псевдокатализа (псевдоэстеразная активность).

Граница так и не25была установлена, как не был наведен порядок в классификации гидролаз.Помимо скорости, более важным фактором для классификации ферментаявляется субстратная специфичность, и проблемы часто возникают при наличиидвух и более центров связывания/активности с разными термодинамическими икинетическими характеристиками.Отом,чтонитрофенилацетатагидролиз(НФА)альбуминомпрактическиэфиров,ничемвнечастности,отличаетсяпот«классического» гидролиза, впервые заявили Casida & Augustinsson еще в 1959г.