Диссертация (Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы), страница 8

Название«параоксоназа» дает ложное представление, будто параоксон является лучшимсубстратом для этого фермента, однако PON1 гидролизует фенилацетат в 1000разбыстрее,чемпредположительнопараоксон[80].Физиологическойявляетсягидролизфункциейгомоцистеин-тиолактона,PON1чтопредотвращает гомоцистеинилирование белков и предупреждает развитиеатеросклероза [99, 100]. Работы Фурлонга и соавт. поставили точку вдлительном споре о субстратной специфичности параоксоназы, доказав, чтопараоксон и фенилацетат гидролизует один и тот же фермент [78, 88], так что40параоксоназаработаетиарилдиалкилфосфатазакак(КФарилэстераза3.1.8.1).(КФ3.1.1.2),Остатки,икакобусловливающиефосфотриэстеразную и эстеразную/лактоназную активность, находятся вразныхместахактивногоцентра[108].Фосфотриэстеразнаяиэстеразная/лактоназная активность фермента настолько тесно связаны, что всовременныхработахобеониявляютсянеотъемлемыматрибутомбиохимического анализа крови [12, 22, 107].

Характеристика и классификацияэтих двух групп эстераз осложняется одной проблемой – отсутствие чистыхпрепаратов ферментов [192]. Таким образом, возможно, что один и тот жеферментвыполняетфункцииарилдиалкилфосфатазы(КФ3.1.8.1),диизопропилфторфосфатазы (КФ 3.1.8.2), арилэстеразы (КФ 3.1.1.2), а такжелактоназы (КФ 3.1.1.25).

Альбумин, как было показано, обладает всемифункциями параоксоназы, но принципиальным отличием альбумина являетсяотсутствиезависимостиотионовСа2+,чтоиспользуетсяпридифференцированном анализе активностей этих ферментов [174, 175, 177, 176].В 1986 г. прозвучало беспокойство по поводу того, что существующаяклассификация эстераз не отражает истинного положения вещей, причем вкачестве примера белка, обладающего эстеразной активностью и не имеющегоместа в классификации, был приведен как раз альбумин [154].

За 30 летситуация не изменилась. И вот уже более свежая статья напоминает нам опроблемахклассификацииипризываетподаватьновыесведенияоферментативной активности белков с целью корректировки существующейноменклатуры [138]. В соответствии с классификацией эстераз, гидролизующихФОС [192], а также с учетом выявленных активностей альбумина, этот белокможно отнести к двум группам (подподклассам): гидролазам эфировкарбоновых кислот (КФ 3.1.1) и фосфотриэстеразам (КФ 3.1.8). Широкаясубстратная специфичность и отсутствие зависимости от Са2+ не позволяетотождествить альбумин ни с одним ферментов, имеющим свой номер вклассификации, так что место альбумина в номенклатуре ферментов ещепредстоит определить, а в качестве рабочей версии можно было бы предложить41как минимум три номера: КФ 3.1.1.103, 3.1.8.3 и 1.11.1.24 (BRENDA. TheComprehensive Enzyme Information System.

http://www.brenda-enzymes.org; посостоянию на 30 мая 2017 г.).1.8. Методы молекулярного моделирования.Для изучения взаимодействия двух молекул наиболее подходящимспособомоценкиявляетсяприменениеметодовквантовоймеханики.Взаимодействие между лигандом и белком может быть описано с помощьюсистемы уравнений Шредингера для обеих систем [1]. После решения системыуравнений получают описание возможных состояний молекул, при которыхони образуют единую систему. Но, как правило, применение квантовомеханического подхода ни к чему не ведет, поскольку невозможно решитьсистему уравнений в общем виде. Можно найти некое численное решение, но вбольшинстве случаев оно далеко от реального состояния системы.

Болеепродуктивным подходом является применение более простой механическоймодели. Необходимо исследовать качество и количество сил, возникающихмежду взаимодействующими частицами. В зависимости от используемогометода можно устанавливать разное соотношение различных силовыхвзаимодействий. В ходе расчетов прибегают к упрощениям. Кроме того,некоторые силы взаимодействия не используются при моделировании [106].Считается, что взаимодействие между частицами - следствие сил различнойприроды, возникающих между частицами. Обычно выделяют 4 категории: 1)силы электростатической природы, 2) силы электродинамической природы, 3)стерические силы, 4) силы, зависящие от растворителя.

Перечисленные силыобъединяет их электромагнитная природа. Величина сил электростатическогопроисхождения зависит от зарядов частиц. Наиболее общие взаимодействия,обусловленные этими силами, - ион-ионное, ион-дипольное и дипольдипольное. Величина этих сил рассчитывается на основания основного законаКулона. Зависимость силы от расстояния между частицами: ион-ионноевзаимодействие - 1/r, ион-дипольное взаимодействие - 1/r2 и диполь-дипольноевзаимодействие - 1/r3, где r – расстояние.42Наиболее известными силами электродинамической природы являютсясилы ван-дер-Ваальса.

Атомы, которые в обычном состоянии электрическинейтральны, могут приобретать индуцированный дипольный момент принаведении внешнего электрического поля. Ван-дер-ваальсовы взаимодействиявозникают между двумя индуцированными диполями и действуют на оченьмаленьких расстояниях. Кроме того, силы возникают между существующимизарядами и индуцированными диполями. Зависимость от расстояния у нихтакая: ион-индуцированный диполь - 1/r4 и диполь-индуцированный диполь 1/r6.Причинойвозникновениястерическихвзаимодействийявляетсяэнтропия, стремление к уменьшению свободной энергии системы.

Силы,возникновениекоторыхобусловленорастворителем,зависятотегоструктурных изменений. Такие изменения возникают, когда ионы, коллоиды,белки и т.д. вносятся в структуру растворителя. Если растворителем являетсявода, необходимо учитывать полярную природу молекул воды. Молекулы водыспособны формировать водородные связи, поэтому, когда молекулы водыокружаютисследуемыйбелок,структурабелкаможетстатьболееупорядоченной, он изменит свою конформацию.Метод молекулярного докинга представляет собой так называемую«стыковку» молекулы лиганда в центре связывания мишени для поискалокального минимума энергии взаимодействия между лигандом и белком.Методпозволяетопределитьфункциональныеособенностимишени,особенности взаимодействия молекул в комплексе, найти лиганды к мишенисреди большого числа молекул, создать новые лиганды.

Молекулярный докингполучил широкое распространение в фармакологических исследованиях. Вкачестветрехмернойструктурылигандаиспользуютсяданныерентгеноструктурного анализа, ЯМР или структуры, полученные методомгомологичного моделирования. Модель лиганда чаще всего строится вхимических редакторах, встроенных в программные пакеты, осуществляющиепроцедуру докинга. Локальный минимум комплекса белок-лиганд ищется43путем перебора вероятных конформаций и положения молекулы лиганда вцентре связывания. Большинство задач связано либо с поиском новыхлигандов, способных наилучшим образом связываться с определенным белком[72, 91], либо с поиском продуктивной конформации комплекса МихаэлисаМентен известных субстратов с ферментом [149, 204].Существует множество программ для теоретической стыковки белков слигандами.

Как правило, они работают по следующему принципу: молекулабелка фиксируется в пространстве, а молекула лиганда поворачивается вокругнего. При этом для каждой конфигурации поворотов производятся оценочныерасчеты с помощью оценочной функции, которая основана на поверхностнойкомплементарности, электростатических взаимодействиях, ван-дер-ваальсовомотталкивании и т.д. Проблема поиска оптимальных конфигураций в том, чтовычисления по всему конфигурационному пространству требуют многовремени и редко приводят к единственному решению [185].Знания о вероятной ориентациимогут быть использованы дляпредсказания прочности комплекса или сродства связей между двумямолекулами с помощью использования других методов, например, методамолекулярной динамики.

Молекулярный докинг также используют в процессевиртуальноговысокопроизводительногосканированиябазданных,чтозначительно снижает затраты. Развитие и оптимизация алгоритмов докинга область активных научных разработок [10]. Существует два основных методадокинга: жёсткий (rigid docking) и гибкий (flexible docking). Метод жесткогодокинга не учитывает конформационную подвижность как белка, так и лиганда.Задача сводится к нахождению оптимальной ориентации лиганда (в конкретнойконформации) в сайте связывания белка.

Этот метод наиболее простой свычислительнойточкизрения.Однакоисследованиеконформационноподвижных лигандов, таких как ГАМК, этим методом затруднительно.Жёсткий докинг сводится к оценке энергии конкретного комплекса. Гибкийдокинг учитывает конформационную подвижность лиганда, но не учитываетконформационную подвижность молекулы белка. Большинство современных44программ докинга работают именно по этому принципу.

Гибкий докинг - этоперебор конформаций и ориентаций лиганда в сайте связывания с оценкойэнергии взаимодействия между белком и лигандом.Наиболеесложныеметодыдокингапозволяютучитыватьконформационную подвижность не только лиганда, но и белка. Наиболеепростойвариантреализациигибкогодокингапозволяетучитыватьконформационную подвижность боковых цепей аминокислотных остатков,расположенныхвсайтесвязывания(inducedfit).Конформационнаяподвижность всей белковой цепочки и другие процессы, происходящие присвязывании лиганда, могут быть исследованы методами молекулярнойдинамики.Метод молекулярной динамики позволяет проследить конформационныеизменения макромолекул во времени.

Впервые был применен для изучениябелковой структуры в 1977 г. [137]. Объектом исследования был небольшойбелок БПТИ, состоящий из 58 аминокислот, в качестве стартовой конформациииспользовалась трехмерная структура белка, полученная двумя годами ранееметодом рентгеноструктурного анализа. Длина симуляции составила 9,2 пс (1пс = 10-12 с). Не учитывалось влияние растворителя, температура неподдерживалась постоянной, однако эта работа стала прорывом в областикомпьютерногомоделированиямоделированияудалосьмакромолекулярныхмакромолекул.рассчитатьструктур.БылМетодомдинамическиепроведенмолекулярногосвойстваанализмногихфлуоресцентнойдеполяризации остатков триптофана [97], изучены динамические свойстваполученных экспериментально параметров ядерно-магнитного резонанса [64],исследовановлияниерастворителяитемпературынаструктуруидинамические свойства белков [64].Метод молекулярной динамики позволяет выявить конкретные деталимеханизма действия макромолекулярных структур, например, какими путямилиганд проникает в активный центр фермента и затем покидает его, а такжеопределить роль различных доменов и аминокислотных остатков в различных45этапах работы белков и нуклеиновых кислот.

С повышением компьютерныхмощностей возможности метода существенно возросли. Сейчас можнорассчитывать поведение систем, состоящих из 105–107 атомов, а период расчетасоставляет несколько наносекунд (нс). Наибольший вклад в развитие методавнесли Берендсен [36], Элбер [206], Йоргенсон [117], ван Гастерен [189].

Расчетдинамических свойств L1-липазы при высоких температурах выявил, какиеименно домены отвечают за конформационные изменения молекулы принагреве [11]. Из методологических работ отметим исследование свойствкатехол-О-метилтрансферазы.Симуляциядлиной70нспоказала,чтоповедение фермента остается стабильным уже после двух десятков наносекунд.Такое время является достаточным для полного расчета динамических свойствбелковой молекулы, поэтому нет смысла гнаться за увеличением длинысимуляции [44].46Глава 2.