Диссертация (Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы), страница 6

С учетом данного аспекта,наиболее масштабное исследование кинетики взаимодействия зомана сальбуминомпредставленовработе[121].Благодарясочетанномуиспользованию методов масс-спектрометрии (MALDI-TOF и тандемныйквадрупольныймасс-спектрометр),31РЯМР-спектроскопии,ионометриифторид-иона, наряду с молекулярным моделированием и биохимическимисследованием ариламидазной активности альбумина, авторы работы решилисистему дифференциальных уравнений и определили следующие кинетическиехарактеристики альбумина по отношению к зоману (обозначения константсоответствуют схеме 4): бимолекулярная константа реакции фосфонилированияальбумина по Tyr411 kp=15±3 М-1×мин-1, константа спонтанной реактивацииTyr411 kr=0,0044ч-1=7,3×10-5 мин-1, константа спонтанного гидролиза зомана(определяли по высвобождению фторид-иона, на схеме она никак необозначена) khо=(3,42±0,07)×10-3 мин-1, константа «спонтанного гидролизазомана в присутствии альбумина» (определяли также по высвобождениюфторид-иона) kh=(7,6±5)×10-3 мин-1.

Таким образом, если сравнить константы,выделенные жирным шрифтом, «спонтанный гидролиз зомана в присутствииальбумина» ненамного, примерно в два раза выше спонтанного гидролизазомана в водном растворе, но в 100 раз (!) превышает по скорости реактивациюсайта Tyr411. Стандартное отклонение довольно большое, но разница в двапорядка между средними величинами не дает оснований сомневаться вдостоверности отличий. Вызывает недоумение другое: авторы изобразилисхему таким образом, что альбумин как будто ни при чем, да и выражение«спонтанный гидролиз зомана в присутствии альбумина» само по себедовольно странное.

А в тексте статьи авторы, похоже, запутались в попыткахобъяснить ими же обнаруженный феномен. В одном только разделе 3.2.2 они32сначала пишут о том, что «альбумин создает физико-химическое окружение,котороеповышаетспонтанныйгидролиззомана»,затемдопускаютсуществование «катализа, который происходит в другом сайте» альбумина, чутьниже высказывают предположение о том, что "альбумин-опосредованныйгидролиз зомана происходит по какому-то механизму без образованияковалентного интермедиата", затем опять предполагают «неферментативнуюфизико-химическую реакцию на границе раздела фаз» и тут же – надо отдать имдолжное - подводят итог в конце раздела: «мы не можем исключатьсуществование второго активного центра».

Они не могли не прийти к такомувыводу по одной простой причине: метод MALDI-TOF, который с большойнадежностью детектирует долгоживущие ковалентный аддукты, позволилзафиксировать ТОЛЬКО ОДИН АДДУКТ АЛЬБУМИНА С ЗОМАНОМ – посайту Tyr411. А потенциал молекулярного моделирования, который позволил быболее уверенно рассуждать об альтернативном механизме «истинного»гидролиза, по сути, не был использован: авторы ограничились моделированиемвзаимодействия зомана все с тем же сайтом Tyr411. В одном из последнихразделов, 4.2.2, авторы снова возвращаются к "необъяснимому" феномену,подчеркивая важность ферментативного «гидролиза зомана во втором сайте(kh=0,0076 мин-1) со скоростью в 100 раз выше оборота в сайте Tyr411».Наконец, в самом последнем абзаце статьи и ее последнего раздела, 4.2.3, вкотором речь идет главным образом о возможных вариантах созданиямутантного рекомбинатного альбумина, авторы допускают возможность того,что "наблюдаемый катализ гидролиза зомана на поверхности альбумина в сайте,отличающимся от Tyr411, можно было бы усилить".Чтобы оценить степень необходимого усиления, в последнем разделестатьи приводятся несложные, но очень важные расчеты.

Как было указановыше, бимолекулярная константа реакции фосфонилирования альбумина поTyr411 kp=15±3 М-1мин-1, и если концентрация альбумина в плазме равна 600мкМ, то для реакции альбумина с зоманом (точнее, с его одним только сайтомTyr411)кажущаясяконстантаскоростипсевдопервогопорядкаравна33kp×[E]=9×10-3 мин-1.Втожевремя,суммарнаяконстантаскоростипсевдопервого порядка для реакции зомана с АХЭ и БХЭ равна 4,5 мин-1, т.е. в500 раз больше. Это значение получается, если концентрацию АХЭ в кровичеловека считать равной 2,5 нМ, концентрацию БХЭ - 50 нМ, отношение kcat/Kdдля этих ферментов - 9×107 M-1мин-1.

Разница в 500 раз - это очень серьезныйвызов,однаконапомним,чтоавторывсвоихрасчетахопираютсяисключительно на стехиометрические свойства одного сайта - Tyr411, которыедействительно трудно усилить в 500 раз. Но если учесть свойствагипотетического второго сайта, который в 100 раз быстрее, да еще икаталитически, а не стехиометрически взаимодействует с зоманом, то задачаусилить эти свойства всего лишь в 5 раз выглядит куда более выполнимой.В связи с обсуждаемой проблемой следует отметить, что реальныевозможности альбумина по детоксикации ФОС не являются сенсацией, этодоказано изящными экспериментами испанской лаборатории под руководствомE.Vilanova [174, 176, 177].

Правда, работали они не с зоманом, а с гораздо менеетоксичными ФОС - параоксоном, хлорпирифосоксоном и др., также не было уних современных ЯМР и масс-спектрометров, ионометров и т.п., но это ничутьне умаляет значимость полученных результатов. Они установили, что уровеньдетоксикации альбумином параоксона в токсикологически релевантныхконцентрациях оказался ничуть не меньше детоксикации параоксоназой, такчто у нокаутных по PON-1 мышей чувствительность к параоксону неотличается от контроля [176]. В этой и особенно следующей работе испанцев[177] недвусмысленно говорится о каталитической активности альбумина,приведены кинетические константы для исследуемых субстратов.

Более того, впротивоположность обсуждаемой выше работе [121], основную роль вдетоксикации ФОС альбумином авторы отводят каталитическому гидролизу, авспомогательную – стехиометрическому взаимодействию с альбумином, и этостоит процитировать: «Мы полагаем, что наиболее вероятный механизмдетоксикации этих субстратов – каталитический гидролиз.

Тем не менее, мыне исключаем возможность альтернативного или одновременного механизма34детоксикации, при котором определенные боковые цепи альбумина могут бытьфосфорилированы или карбамилированы без каталитического оборота» [177].И еще одна цитата из этой же работы: "Роль гидролитической активностиальбумина недооценивали из-за его низкой каталитической эффективности, ...однако низкая каталитическая эффективность компенсируется чрезвычайновысокой концентрацией фермента (46 мг/мл, 670 мкМ)". В унисон с работой[121], но куда более четко и определенно.Согласно О.Локридж, Tyr150 не только не фосфонилируется привзаимодействии с зоманом, но не входит в перечень ацетилированныхтирозинов даже при "тотальном" насыщении альбумина ацетильными группами(при этом ацетилируются 4 тирозина: Tyr84, Tyr161, Tyr401, Tyr411) [126].

Вусловиях 5 мин инкубации 15 мкМ альбумина с 500 мкМ НФА при 22 оС былацетилирован лишь один только сайт Tyr411, а для того чтобы ацетилироватьвсе 82 сайта, потребовалась нефизиологически «жесткая» инкубация альбуминас 10мМ (!) НФА в течение 48ч (!). Полупериод деацетилирования Tyr411альбумина при pH=8,0, 22оC составил 61±4 ч [126]. Не удивительно поэтому,что в одном из последних обзоров [113] рассматриваются лишь два сайтапретендента на (псевдо)эстеразную активность альбумина: это Tyr411 и Lys199.Сайт Tyr411 именуется тем сайтом, который отвечает за «истинный гидролиз»(real hydrolysis), поскольку субстрат (эфир) расщепляется на две молекулы, обеиз которых высвобождаются, а для расщепления необходима молекула воды.

Вотличие от Lys199, который также отвечает за расщепление субстрата (напр.,аспирина) на два продукта, лишь один из которых (салицилат) высвобождается,тогда как второй (ацетат) связывается ковалентной связью с ε-аминогруппойLys199, остается связанным с ней неопределенно долго, и – что самое главное при расщеплении аспирина молекула воды не задействована (как будто оназадействована на первой стадии расщепления ФОС, НФА или другого эфира).Вот, оказывается, каким может (или должен) быть главный критерийгидролазной активности вообще и эстеразной в частности: участие молекулыводы в расщеплении субстрата. Но поскольку вода участвует в высвобождении35второй части субстрата всех эстераз, на первый план опять выходит«продолжительность жизни» ковалентной связи, этого камня преткновения напути достижения консенсуса в вопросе о каталитических свойствах альбумина.Очевидно, одна из главных причин медленного гидролиза альбуминомНФА и других эфиров – отсутствие каталитической триады и оксианионногоцентра [164].