Диссертация (Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы), страница 2

Проведен сравнительный кинетический иингибиторный анализ начальных скоростей гидролиза НФА на двух стадияхактивности (предстационарное и стационарное состояния) БСА, ЧСА, КСА.Определены константы диссоциации и проведен анализ реципрокного влиянияосновных сайтов альбумина при взаимодействии с негидролизуемымилигандами (варфарин, ибупрофен). Установлена высокая селективностьибупрофена к сайту Садлоу II и низкая селективность варфарина к сайтуСадлоу I. Методами молекулярного моделирования впервые изучены процессывзаимодействия альбумина с НФА, параоксоном, стереоизомерами зомана,специфическими ингибиторами сайтов Садлоу I и II. Установлено, что ФОСмогут продуктивно взаимодействовать с сайтом Садлоу I альбумина; помимоTyr150 и Tyr411 ЧСА, с зоманом могут продуктивно взаимодействовать Ser193и Lys402. При этом установлено, что толькоP(-) изомеры зомана(обусловливающие его высокую токсичность) связываются с этими сайтами нарасстоянии, достаточно близком для нуклеофильной атаки кислородом (азотом)фосфора зомана.Теоретическое и практическое значение работы.Обнаруженные сходства и различия альбумина разных видов животныхпозволят точнее оценивать экспериментальные данные с учетом видовойспецифики, что важно в свете задач трансляционной медицины, т.к.

пониманиеособенностей фармако- и токсикокинетики многих соединений в организмегрызуновтребуетсядляадекватнойинтерпретацииихкинетическихзакономерностей в организме человека. Так, с НФА и параоксоном в качествесубстрата установлено, что функциональные характеристики обоих сайтовСадлоу альбумина крысы и человека ближе между собой и существенноотличаются от характеристик бычьего альбумина. Отсюда следует, что в9экспериментальных моделях in vitro необходимо использовать ЧСА, а не болеедешевый и доступный БСА. Кроме того, учитывая наличие карбоксилэстеразыв плазме крови грызунов, в моделях in vitro и in vivo с грызунами необходимоиспользовать ингибиторы карбоксилэстераз.Предложена схема и математическая модель для описания эстеразнойактивностиальбумина,впервыепроведенбиохимическийанализфункционирования двух сайтов альбумина в сочетании с анализом in silico.Результаты важны для развития методологии доклинических исследованийфармпрепаратов.

Сочетание методов теоретической и экспериментальнойоценки (псевдо)эстеразной активности альбумина позволит найти способынаправленного воздействия на определенные сайты или молекулу альбумина вцелом лигандами природного и искусственного происхождения, повышаятаким образом эффективность не только антидотной терапии, но и терапииразличных заболеваний.Публикации и апробация работы.Материалы диссертационной работы опубликованы в 10 статьях вжурналах, рекомендованных ВАК РФ, и в 5 статьях и тезисах в сборникахконференций.Результатыисследованийдоложенынамеждународнойпущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века»(Пущино,2011),намеждународнойконференции«Рецепторыивнутриклеточная сигнализиция» (Пущино, 2011), на 11-й международнойконференции по холинэстеразам (Казань, 2012), на 1-й международной научнопрактической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии,лабораторной и клинической медицине» (Москва, 2010).Личный вклад.Автор участвовал во всех экспериментах, представленных в даннойработе,проводилстатистическуюобработкуполученныхрезультатов,участвовал в написании тезисов и статей, представлял результаты наконференциях.

Ряд работ выполнен при участии сотрудников Института10эволюционной физиологии и биохимии им.И.М.Сеченова РАН в рамкахгрантов РФФИ и РНФ, что нашло отражение в соответствующих публикациях.Структура и объем диссертации.Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста,содержит 26 таблиц и 40 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы,описанияметодовобсуждением,исследования,заключенияи6экспериментальныхвыводов.Библиографиярусскоязычных и 200 англоязычных источников.разделоввключаетс1111Глава 1.

Обзор литературы1.1. Общая характеристика альбумина.Альбумин – это главный белок крови млекопитающих, где егоконцентрация составляет 500-700 мкМ. Альбумин синтезируется в печени соскоростью примерно 0.7 мг в час (т.е. 10-15 мг в день), период полураспадасывороточного альбумина человека (ЧСА) составляет 19-20 сут [156].Молекула альбумина не покрыта углеводной оболочкой и может связыватьсамые разные молекулы и атомы: воду и катионы металлов (Са2+, Zn2+, Cu2+,Ni2+, Cd2+, Co2+, Pt2+, Au+), свободные жирные кислоты и жирорастворимыегормоны, неконъюгированный билирубин, соли желчных кислот, трансферрин,окись азота, аспирин, варфарин, фенилбутазон, клофибрат, фенитоин и т.д. [71].Связывая лекарства и токсические вещества, альбумин в значительной степениопределяет их фармако- и токсикокинетику, транспортируя к тканям-мишенямили местам их биотрансформации.

Связывание происходит по двум первичнымсайтам и нескольким вторичным, количество которых зависит от физикохимических свойств веществ и состояния молекулы альбумина (Рис. 1.1). Так,для жирных кислот – основного лиганда альбумина – имеется 7 сайтовсвязывания, причем связавшиеся жирные кислоты изменяют полярность иобъем сайтов связывания лекарственных препаратов [84].Первыепубликации,посвященныеисследованиюсывороточногоальбумина, датируются концом 19-го века [127]. К середине 20-го векаежегодно публиковали десятки работ, в 1960-х - сотни, а в 1970-х их счетперевалил за тысячу. Удивительно при этом, что трехмерная структураальбуминасывороткикровичеловекабылаисследованасвысокимразрешением довольно поздно, лишь в 1990х [89, 182]. Аналогичная структурабычьего сывороточного альбумина (БСA) получена в 2012 г., а трехмернаяструктура крысиного альбумина (КСA) не получена до сих пор.

Молекуласывороточного альбумина образована одной полипептидной цепью, состоящейиз 585, 584 и 583 аминокислотных остатков для альбумина человека, крысы ибыка, соответственно [53, 129, 180]. Структура альбумина консервативна для12всех млекопитающих: молекула состоит из трех гомологичных доменов,каждый из которых состоит из десяти спиралей и может быть разделен на двасубдомена, A и В, содержащих шесть и четыре спиралей, соответственно; этидва субдомена соединены длинной петлей [42]. Молекула альбумина человека ибыка имеет 17 дисульфидных связей и один остаток цистеина со свободной SHгруппой [42, 84].

В первичной последовательности крысиного альбуминастолько же остатков цистеина, сколько в последовательности человека и быка,и они расположены в тех же позициях [179], поэтому есть все основанияпредполагать, что RSA также имеет 17 дисульфидных связей и один одиночныйцистеинвсвоейтрехмернойструктуре.Выравниваниепервичныхпоследовательностей аминокислотных остатков молекул ЧСA, КСA и БСA спомощью Clustal Omega [171] показало, что наибольшей идентичностьюобладают молекулы ЧСA и БСA – 75,6%. Однако процент идентичностипервичной структуры у молекул ЧСA и КСA составляет 73,0%, а у БСA и КСA— 69,9%. Если же сравнить непосредственно аминокислотные остатки сайтаСадлоу I (сайт Садлоу II у всех трёх видов альбумина консервативен), то здесьуже молекулы ЧСА и КСА обладают наибольшей идентичностью – 75%, в товремя как БСA демонстрирует лишь 57% идентичность как с КСA, так и с ЧСA.Кроме того, у БСA преобладают замены лизиновых остатков на аргининовые всайте Садлоу I (Lys195→Arg195, Lys199→Arg199), что может сказываться наего конфигурации, поскольку боковые цепи аргинина сильнее разветвлены.Трехмерная структура альбумина достаточно лабильна, так что привзаимодействии с молекулой альбумина разных веществ имеют место такиеэффекты как кооперативность и аллостерическая модуляция, обычно присущиемультимерным белкам [18].13Рисунок 1.1.

Кристаллическая структура альбумина человека. На рисункепоказана кристаллическая структура альбумина человека, полученная набелке, растворенном в присутствии насыщающих концентрацийпальмитиновой кислоты. Три домена имеющие α-спиральные структуры(DI, DII и DIII) делятся на субдомены (A и B), как указано на рисунке.Домен DI (розовый) содержит сайт связывания жирных кислот 1,свободный цистеин (C34) и сайт связывания лекарственных веществ 3.Сайт связывания жирных кислот 2 расположен между доменами DI и DII.Участок связывания металлов расположен между субдоменом DIA иDIIA.

Домен DII (оранжевый) содержит сайт связывания лекарственныхвеществ 1 (сайт Садлоу 1), а также сайты связывания жирных кислот 6 и7. Домен DIII (синий) содержит сайты связывания жирных кислот 3 и 4,связывания лекарственных веществ 2 (сайт Садлоу 2) в субдомене DIIIA,и сайт связывания жирных кислот 5 в домене DIIIB. Примеры эндогенныхи экзогенных лигандов для сайтов связывания, для которых полученыкристаллические структуры, указаны зеленым и красным соответственно.Этот рисунок был получен с использованием кристаллической структурычеловеческого альбумина в присутствии пальмитиновой кислоты с PDBфайлом 1E7H в программе PyMol. CMPF - карбокси-4-метил-5-пропил-2фуранпропионовая кислота; NO - оксид азота [166].14Однако, в силу вышеуказанных различий первичных структур, порезультатам исследования функциональных характеристик альбумина одноговида животных нельзя a priori утверждать, что альбумин другого вида будетобладать такими же характеристиками.

Например, ЧСA при взаимодействии сжирными кислотами в растворе обладает высокой пластичностью и гибкостью,тогда как характеристики БСA в растворе по отношению к жирным кислотам несильно отличаются от расчетных данных, полученных для его кристаллическойструктуры [161].1.2. Эстеразная и псевдоэстеразная активность альбумина.Альбумин является не только пассивным, но и активным участникомфармако- или токсикокинетических процессов. В первую очередь насинтересует взаимодействие альбумина с эфирами.