Диссертация (Изучение роли рецептор-подобной киназы К1 гороха в контроле формирования симбиотических субклеточных структур), страница 7

extracellular – внеклеточный) (выявленытолько на основании анализа геномов растений)4.Внутриклеточныенесекретируемые–LysMn(отангл.non-secretory–несекретируемые) (выявлены только на основании анализа геномов растений).2.3. LysM-содержащие рецепторы - участники иммунного ответа у растений.LysM-рецепторы входят в особый класс белков – паттерн распознающих рецепторову растений (от англ.

pattern-recognition receptors, PRR), участвующих в узнавании ивзаимодействии с микроорганизмами. Эта функция осуществляется, главным образом, приузнавании молекулярных структур микроорганизмов, вызывающих иммунный ответ(MAMPs) рецепторами PRR (Medzhitov, Janeway, 1997; Nurnberger et al., 2004). Хитин и егочастично деацетилированная форма, хитозан, у грибов были одними из первых MAMPs,для которых было показано участие в активации иммунного ответа у растений (Hamel,Beaudoin, 2010; Shibuya, Minami, 2001; Iriti, Faoro, 2009; Felixe t al., 1993; Ren, West, 1992).С момента открытия свойств хитина и его производных выступать в качестве индукторовиммунных реакций у растений, большой интерес представлял поиск рецепторов к этомуклассу соединений у двудольных и однодольных растений.Наличие связывающих сайтов для хитина (от англ.

chitin-bindingsites) вплазматической мембране клеток корня было показано для риса (O. sativa), томата и сои(Glycine max) (Baureithel et al., 1994; Day et al., 2001; Shibuya et al., 1993; Shibuya et al.,1996;) еще задолго до идентификации первого хитинового рецептора. Впервые рецептор кхитину был выявлен у риса. Было показано, что это LysM-содержащий рецептор,локализованный в плазматической мембране, он получил название OsCEBiP (от англ. chitinelicitor binding protein – белок, связывающий элиситор-хитин) (Kaku et al., 2006).

Показано,что он состоит из внеклеточного домена с двумя LysM-мотивами, трансмембранногодомена, но не содержит киназный домен (LYP белок). OsCEBiP играет важную роль всвязывании хитина и хитоолигосахаридов и активации сигнального каскада в ответ надействие этих молекул (Kaku et al., 2006). Подавление синтеза этого рецепторного белкаприводит к значительному снижению проявления защитных реакций у риса в ответ наобработку хитином и хитоолигосахаридами. Отсутствие у рецептора OsCEBiP киназногодомена, отвечающего за передачу сигнала, позволяет говорить о том, что он работает вкомплексе с другим рецепторными или рецептор-подобными киназами, обладающимактивным киназным доменом (Kaku et al., 2006, Shimizu et al., 2010).

Действительно,позднее у риса был выявлен другой рецептор OsCERK1, вовлеченный в связываниехитоолигосахаридов (Miya et al., 2007, Wanet al., 2008). OsCERK1 содержит три LysM28мотива во внеклеточном домене, трансмембранный домен и функциональный киназныйдомен (Shimizu et al., 2010). Мутации по гену cerk1 у риса приводят к значительномуподавлению защитных реакций в ответ на обработку хитоолигосахаридами, что указываетна важную роль OsCERK1 в их развитии. Анализ возможного взаимодействия белковOsCEBiP и OsCERK1 с помощью дрожжевой двугибридной системы, показал, что эти белкиспособны формировать гетеродимер. И дейтвительно, опыты по иммунопреципитациипоказали, что белки OsCEBiP и OsCERK1 способны формировать гетеродимерныйрецепторный комплекс при связывании хитоолигосахаридов, хотя в клетке в неактивномсостоянии OsCEBiP существует в основном в виде гомодимера в плазматической мембране(Shimizu et al., 2010).Недавние исследования показывают, что OsCEBiP непосредственно связывает хитини хитоолигосахариды, то есть проявляет биохимическую функцию рецептора кэтимлигандам (Hayafune et al., 2014; Kouzai et al., 2014).

При узнавании хитоолигосахаридов,состоящих из 8 остатков N-ацетилглюкозамина (хитооктаозы), в мембране клеток корнейриса происходит формирование сложного комплекса рецепторов. Показано, что 2 белкарецептора OsCEBiP связываются с разных сторон с молекулой лиганда (GlcNAc)8, чтоприводит к димеризации OsCEBiP. Затем к этому комплексу присоединяется молекулабелка OsCERK1. Таким образом, в узнавании молекулы хитооктаозы участвуетгетеротримерный комплекс (Hayafune et al., 2014).У A.

thaliana, AtCERK1 содержит, в отличие от OsCERK1, три LysM-мотива вовнеклеточном домене, а также активный киназный домен. Показано, что мутанты по генуcerk1 не способны отвечать на действие хитоолигосахаридов (Miya et al., 2007, Wan et al.,2008). Кроме того, установлено, что внеклеточный домен AtCERK1 вовлечен в связываниехитина и хитоолигосахаридов, но не связывается с близкими по химическому строениюолигомерами N-ацетилгалактозамина и хитозаном (Iizasa, 2010). У A. thaliana наиболеесильная активация защитных реакций происходит при действии хитоолигосахаридов состепенью полимеризации 7 и 8 остатков N- ацетилглюкозамина.Рецептор-подобная киназа AtCERK1 способна узнавать также более короткиеолигомеры хитина, состоящие из меньшего числа остатков N-ацетилглюкозамина (n = 4, 5),однако при этом активации защитных реакций не происходит.

Только хитоолигосахаридысо степенью полимеризации 7 и 8 являются сильными индукторами защитных реакцийрастений. В основе таких различий лежит способность AtCERK1 формироватьгомоолигодимерный рецепторный комплекс AtCERK1/ AtCERK1 только при связываниигепта- и октамеров хитина (n = 7 и 8), что приводит к активации киназного домена ипередаче сигнала (Liu et al., 2012). При узнавании тетрамерных хитоолигосахаридов29отдельными молекулами рецептора AtCERK1 формирования такого гомоолигомерногокомплекса не происходит, поскольку только хитоолигосахариды (n = 7 и 8) способнысвязывать две молекулы рецептора в комплекс. Было показано, что димеризациярецепторов при узнавании хитоолигосахаридов (n = 8) приводит к активациивнутриклеточного киназного домена (Liu et al., 2012; Petutschnig et al., 2010).Однако у AtCERK1 A. thaliana была выявлена низкая аффинность (Кd ~ 45мкМ) кхитоолигосахаридам (Liu et al., 2012).

Более того, мутация в гене cerk1, которая приводит кзамене аминокислоты (A138H) в киназном домене и должна влиять на фосфорилированиекиназного домена AtCERK1, не нарушала его функциональной активности (Liu et al., 2012).Это указывало на возможность, участия в связывании хитолигосахаридов рецептора с болеевысокой аффинностью к этим молекулам. Действительно, у A. thaliana были выявлены двамутанта по генам lyk5 и lyk4, которые характеризовались снижением устойчивости кзаражению фитопатогенными грибами и обработку растений хитином.

Например, мутациив гене Atlyk4 значительно снижали ответ растений на обработку хитином (Wan et al., 2012),хотя фенотип таких мутантов не был таким ярко выраженным, как у мутантов Atcerk1.Действительно, недавние исследования показали, что другой рецептор A. thalianaAtLYK5 (по новой классификации это LYR рецептор, поскольку у него киназный домен неявляется функциональной киназой) является основным белком, связывающим хитин ихитоолигосахариды (Cao et al., 2014).

При этом он формирует комплекс с AtCERK1.Мутации в гене lyk5 приводят к значительному снижению ответных реакций растенийарабидопсиса на хитин. Однако AtLYK5, по-видимому, разделяет эту функцию с AtLYK4,поскольку лишь у двойного мутанта Atlyk4/Atlyk5-2 происходит полная потеря способностирастения реагировать на патогенную атаку. Метод колориметрического титрованияпоказал, чтоAtLYK5 более эффективно связывает хитооктаозу, чем AtCERK1 (Kd= 1,72мкM у AtLYK5 и Kd ~ 45 мкM у AtCERK1). Данные показывают, что AtLYK5 необходимдляформированиягетеродимерногокомплексасAtCERK1,чтовызываетфосфорилирование киназного домена AtCERK1.

При этом, несмотря на то, что киназныйдомен АtLYK5 является неактивным, он необходим для взаимодействия с киназнымдоменом AtCERK1. Белок AtLYK5 также способен к гомодимеризации в отсутствиилиганда. Интересно, что возможность формирования комплекса показана также междуAtLYK4 и AtCERK1 при отсутствии лиганда, в то время как комплекс AtLYK5/ AtCERK1образуется только в присутствии хитина и олигомеров хитина.

Роль AtLYK4 в контролеиммунного ответа растений еще предстоит выяснить (Cao et al., 2014).Дополнительным компонентом в передаче сигнала от олигомерного рецепторногокомплекса AtLYK5/ AtCERK1 является LysM-РПК AtLIK1 (от англ. LysMinteractingkinase 130– LysM взаимодействующая киназа 1), которая взаимодействует с AtCERK1 и необходимадля развития иммунного ответ растения (Le et al., 2014).АктивацияCERK1приводиткактивациипутипередачисигналаифосфорилированию компонентов сигнального каскада – MAP киназ (от англ. mitogenactivated protein – митоген-активированный белок) MPK3 andMPK6 (Miya et al., 2007). Впередаче сигнала после связывания рецептором хитина и хитоолигосахаридов участвуютWRKY транскрипционные факторы (Wan et al., 2012).Влияние пептидогликана муреина на растение впервые было описано для табакаNicotianatabacum(производных(Felix,Boller,2003).полимераНесколькомуреина),позжевыделяемыхвлияниемуропептидовграмположительнымииграмотрицательными бактериями было изучено у A.

thaliana (Erbs et al., 2008; Gust et al.,2007; Millet et al., 2010). Недавно у A. thaliana было выявлено два LysM рецепторных белка,AtLYP1 и AtLYP3, ответственных на связывание пептидогликанов (Willmann et al., 2011).AtLYP1 и AtLYP3 являются связанными с мембраной белками и структурно напоминаютOsCEBiP риса, но у них нет трансмембранного домена. Они участвуют в развитиииммунного ответа при узнавании растениями этих лигандов.

Важно отметить, что реакцияна хитин и хитоолигосахариды у растений, имеющих нарушения в генах, кодирующихAtLYP1 и AtLYP3, не изменяется. Мутанты lyp1 иlyp3 обладают повышеннойчувствительностью к бактериальной инфекции, но эта чувствительность не увеличиваетсяу двойного мутанта lyp3/lyp1. Этот факт говорит о том, что оба белка являются частьюодной и той же узнающей системы (Willmann et al., 2011), хотя экспериментальных данныхо возможности формирования гетеромерного комплекса с участием LYP1 и LYP3 полученопока не было. Однако важно отметить, что нарушение функции AtCERK1 у мутанта по генуcerk1 связано с такими же фенотипическоми проявление, что и у мутантов lyp1 и lyp3(Willmann et al., 2011; Gimenez-Ibanez et al., 2009).

Это может свидетельствовать о том, чтоу A. thaliana формируется гетеротримерный комплекс для узнавания мутерина и егопроизводных, состоящий из LYP1, LYP3 и AtCERK1 и необходимый для передачи сигналав клетку (Willmann et al., 2011).У другого растения, риса, недавно были выявлены гомологи AtLYP2 и AtLYP3 OsLYP4 и OsLYP6, которые также необходимы для связывания муреина (Liu et al., 2012).Таким образом, при формировании различных комплексов с вспомогательными белкамирецепторами реализуется способность растений узнавать близкие построению соединения,состоящие из остатков N-ацетилглюкозамина.Недавно у риса была обнаружена цитоплазматическая РПК OsRLCK176,участвующая в передачу сигнала от комплекса OsCEBiP/OsCERK1 при узнавании31растением хитина, муреина и их производных.