Диссертация (Изучение роли рецептор-подобной киназы К1 гороха в контроле формирования симбиотических субклеточных структур), страница 10

viciae CIAM 1026, любезно предоставленный с.н.с. Ахтемовой Г.А.(ФГБНУ ВНИИСХМ). Для трансформации растений гороха использовали штаммAgrobacterium rhizogenes Arqua 1.Трансформацию листьев Nicothiana benthamiana для временного синтеза белковпроводили с помощью штаммов A. tumefaciens LBA4404 (любезно предоставлен докторомCullimore, Тулуза, Франция) и A. tumefaciens GV3101::pMP90(RK), предоставленный в.н.с.Захарченко Н.С.

(филиал института биоорганической химии им. Шемякина и Овчинникова,Пущино, Россия).При работе с дрожжевой дигибридной системой использовали коммерческий штаммSaccharomyces cerevisiae MaV203 (Invitrogen, США).2.2. Условия культивирования микроорганизмов.Штаммы E.

coliкультивировали на твердой или в жидкой среде LB (Bertani, 1951)при 37˚С до достижения культурой необходимой плотности. Для селекции устойчивых кантибиотикам бактерий добавляли их к среде в следующих концентрациях: ампициллин –100 мкг/мл, канамицин – 50 мкг/мл, тетрациклин – 10 мкг/мл.Штаммы ризобий для инокуляции растений гороха культивировали на орбитальномшейкере (220 об/мин) в жидкой среде YEB (Krallet al., 2002) или TY (5 г/л триптона, 3 г/лдрожжевого экстракта, 0,5 г/л CaCl2), содержащей стрептомицин в концентрации250мкг/мл, при 28˚С.Штаммы Agrobacterium культивировали в среде TY, содержащей необходимыйантибиотик, при 28˚С.Штамм дрожжей S.

cerevisiae MaV203 выращивали на среде YPD (1% дрожжевогоэкстракта, 2% пептона, 2% глюкозы, 2% агар). Селекцию дрожжей при анализевзаимодействий белков с помощью дрожжевой дигибридной системы вели на полнойсинтетической среде (SC, Invitrogen, США) в отсутствии селектирующих агентов.402.3. Растительный материал.Исследования проводили на растениях гороха Pisum sativum L. сорта Finale,мутантной линии RisNod4, мутантной линии Rondo K24, а также сорте Frisson изгенетической коллекции ФГБНУ ВНИИСХМ, линии Cameor, любезно предоставленномЖуковым В.А., а также мутантных линиях P. sativum L. 885, 817, 2265 полученные наоснове Cameor из коллекции института сельскохозяйственных исследований (INRA,Франция).2.4.

Условия выращивания растений.Семена N.benthamiana стерилизовали с помощью 10% гипохлорита в течение 5минут, затем промывали 5 раз водой. Обработанные семена оставляли на ночь при +4° Cна чашке со стерильной фильтровальной бумагой, смоченной водой. Затем семенапереносили в пластиковую коробку с грунтом, через 7 дней проростки переносили вотдельные горшки.

Растения выращивали при температуре 25°C длительность световогодня - 16 ч, 60% влажности в течение 3 недель.Семена гороха стерилизовали концентрированной серной кислотой в течение 5минут, затем промывали стерильной водой не менее 5 раз. Обработанные семена помещалина чашки с 1% водным агаром. Проращивали растения в темноте в течение 4-5 дней прикомнатной температуре.

Проростки переносили в горшки с вермикулитом, политымжидкой средой Jensen (van Brusselet al., 1982). Растения гороха также выращивали притемпературе 21ºС, длительности светового дня - 16 ч, 60% влажности. Инокуляциюпроводили, добавляя 1 мл суспензии R. leguminosarum bv. viciae CIAM 1026 (OD600 = 0,5).Для анализа экспрессии генов на разных этапах развития симбиоза были собраны –фрагменты главных корней (1 – 14 дней после инокуляции) и клубеньки на 21 – 28 днейпосле инокуляции.2.5.

Олигонуклеотиды и ферменты.Олигонуклеотиды были синтезированы в компании «Евроген» (г. Москва). Былииспользованы эндонуклеазы рестрикции, ДНК-лигаза фага Т4, смесь для полимеразнойцепной реакции (ПЦР) с высокоточной полимеразой PhusionFlash, BP и LR-клоназы(ThermoScientific, США)412.6. Компьютерные и интернет-ресурсы.Для поиска нуклеотидных последовательностей была использована база данныхGenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/). Для анализа доменной структуры белковбыл использован сервис TMHММ Server v. 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHММ/).Для предсказания молекулярной массы белков на основании исходной нуклеотиднойпоследовательности была использована подпрограмма EditSeq программы DNAStar(Invitrogen, США).2.7.

Выделение ДНК растений.50 мг листьев гороха растирали в жидком азоте до состояния пудры. Добавляли 250мкл буфера для экстракции (600 мМ NaCl, 100 мМ трис-HCl, 40 мМ ЭДТА, 4% сахарозы,1% додецилсульфата натрия), смешанного в соотношении 1:1 со свежеприготовленной 10М мочевиной. После оттаивания смеси вносили 250 мкл буфера для экстракции.Переносили смесь в 1.5 мл эппендорф и добавляли 500 мкл фенол-хлороформа,перемешивали на встряхивателе (Vortex, Германия) в течение 1 мин. Центрифугировалисмесь 10 мин при 14000 об/мин при комнатной температуре. Переносили супернатант вчистый эппендорф и добавляли 0,7 объема изопропанола, аккуратно смешивали,переворачивая эппендорф 3 раза. Центрифугировали 10 мин, 14000 об/мин при комнатнойтемпературе, получившийся осадок промывали 500 мкл 70% этанола и осаждали в течение1 мин.

Высушивали осадок при комнатной температуре и растворяли в 50 мклдеионизированной воды. Качество выделения проверяли форезом, для ПЦР использовали 1мкл ДНК, разведенной деионизированной водой 1:100.2.8. Выделение РНК растений.Для выделения РНК использовали корни растений гороха (около 100 мг ткани),собранные на разных сроках после инокуляции ризобиями. Образцы растирали в ступке вжидком азоте. К образцу добавляли 1 мл реагента Trizol (Invitrogen, США), тщательноперемешивали, давали оттаять при комнатной температуре и переносили в 1,5 мл пробирку.Образцы перемешивали на встряхивателе 3 минуты и центрифугировали 10 мин при 14000об/мин (Mikro 22RHettich, Германия), +4 ºС.

Надосадочную жидкость переносили в 1,5 млпробирку, добавляли к каждому образцу по 200 мкл хлороформа, перемешивали навстряхивателе и центрифугировали 15 мин при 14000 об/мин (Mikro 22RHettich, Германия)при 4 ºС. К супернатанту добавляли равный объем изопропанола, тщательно перемешивали42на встряхивателе, инкубировали 10 мин на льду. РНК осаждали при 14000 об/мин в течение10 мин при 4 ºС.

Осадок промывали 70% этиловым спиртом. После удаления спирта,подсушивали осадки и каждый растворяли в 40 мкл деионизированной воды. Проводилиобработку проб ДНКазой (1 U/ 1 мкг РНК) при 37 ºС в течение 30 мин. После этого доводилиобъем пробы до 200 мкл. Проводили обработку равным объемом хлороформа.Центрифугировали 10 мин при 14000 об/мин, 4 ºС.

К водной фазе, содержащей РНК,добавляли 1/10 объема 3М Na-ацетата (до конечной концентрации реактива 0,1 М) и 2,5объема 96% этилового спирта. Инкубировали ночь при -80 ºС. Центрифугировали 30 минпри 14000 об/мин, 4 ºС. Осадок промывали 70% спиртом и растворяли в 20 мклдеионизированной воды. Качество выделенной РНК проверяли с помощью электрофорезав 1,5% агарозном геле, концентрацию РНК в пробах измеряли на спектрофотометреBioSpecMini 230 (Shimadzu BioTech, Япония).2.9. Синтез комплементарной ДНК и количественная ПЦР, совмещеннаяс обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).Комплементарная ДНК (кДНК) была синтезирована на матрице РНК (1 - 2,5 мкг) спомощью обратной транскриптазы RevertAidH-(ThermoScientific, США) с использованиемолиго(дT) праймеров (Sileks, www.sileks.com).

Синтез проводили в реакционной смесиобъемом 20 мкл, содержащей 10 мМ Трис-HCl (pH 8.8), 50 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 1 мМдезокси-нуклеотидтрифосфатов (дНТФ), 100 пМ праймера олиго(дT), 1 ед. ингибиторарибонуклеаз и 200 ед. обратной транскриптазы RevertAidH-, в течение 1 ч при 42°С. Передначалом реакции водный раствор, содержащий РНК и праймер олиго(дT), прогревали втечение 5 мин при 65°С.

После завершения реакции синтеза для инактивации обратнойтранскриптазы смесь прогревали 1 мин при 95°С. Пробы разводили водой до конечногообъема 200 мкл (1: 10). Для проведения ПЦР использовали 2 мкл разведенной кДНК. ПЦРв реальном времени проводили с использованием прибора CFX96 Real-Time (BioRadLaboratories, США) и готовой смеси qPCRmix-SYBR (Евроген, Россия).

Списокпраймеров для проведения ПЦР в реальном времени приведен в Таблице 1. Уровень мРНКбыл нормализован относительно двух конститутивно экспрессируемых генов – убиквитинаи актина (последовательности праймеров приведены в Таблице 1). Значения на шкалеординат (Y) были представлены как отношения уровней экспрессии генов в варианте синокуляцией к контролю (варианте без инокуляции). Для анализа уровня экспрессии генов,кодирующих LysM-РПК гороха, было проанализированы 2 независимые биологическиеповторности.43Таблица 1. Праймеры, использованные для анализа экспрессии генов методомколичественной ОТ-ПЦР.Название праймераПоследовательность 5’ - 3’K1_FCGCGATGTAAAATCAGCAAACATATTGK1_RCGTCACCATATTGAGCATATTCTGGSym10_FGTACTTCATTGGCGGAGACTGSym10_RCCATAAGTTTCACAAGATTTCCATSym37_FAACAGAATTCCTTTGCGAGTTGCASym37_RTGGTAATGGCGCTTTATCTATACАктин_FCTCAGCACCTTCCAGCAGATGTGАктин_RCTTCTTATCCATGGCAACATAGTTCУбиквитин_FTGAGAATCAACACACTTCTCCAAGGУбиквитин_RGCATTAAGAATTTCCCCAGAGGTCENod5_FCGA TAC TAT CGA TGT AGT GGENod5_RGAC TGT AAT TGA CCT TCA CCENod12_FTCA CTA GTG TTG TTC CTT GCENod12_RCCA TAA GAT GGT TTG TCA CGNIN_FCCG CAA AGA GCA TCG GTG TAT GNIN_RGCA TAG AAA GAT CCA ATC TGT ATA GCDNF2_FTCAATACTCATGGCTTACAACTCADNF2_RCACTTCCATTTTTCGGCATTTTATSymCRK_FGGAAGAAATGGTGGGAAAATAGGSymCRK_RTGTAAAATGCTGGCTGTTGAGGPR1_FGGG GTC CAT ATG GTG AGA ACPR1_RTAA TTA CCA GGT GGA TCA TAG TTA CAPR10_FGCC GGA ACC ATC AAG AAA CTPR10_RGCC TTG AAA AGA CCA TCA CCC2.10.