Диссертация (Изучение роли рецептор-подобной киназы К1 гороха в контроле формирования симбиотических субклеточных структур)

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕУЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИНа правах рукописиКИРИЕНКОАнна НиколаевнаИЗУЧЕНИЕ РОЛИ РЕЦЕПТОР-ПОДОБНОЙ КИНАЗЫ К1 ГОРОХА В КОНТРОЛЕФОРМИРОВАНИЯ СИМБИОТИЧЕСКИХ СУБКЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУРШифр и наименование специальности:03.01.05 Физиология и биохимия растений03.02.03 МикробиологияДиссертацияна соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:доктор биологических наук Долгих Елена АнатольевнаСанкт-Петербург20182СодержаниеУсловные обозначения и сокращения ......................................................................................... 5Введение.

........................................................................................................................................ 6Глава I. Обзор литературы. .........................................................................................................

10Часть 1. Необходимость рецепторов для регуляции жизнедеятельности растений. ............ 101.1. Рецепторы, связанные с G-белками. ................................................................................... 121.2. Рецепторы, взаимодействующие с системой убиквитинирования. ................................ 141.3. Ионные каналы.

.................................................................................................................... 151.4. Рецепторы, связанные с ферментами. ................................................................................ 161.4.1. Разнообразие растительных рецептор-подобных киназ. ....................................... 18Часть 2. Участие LysM-содержащих рецепторов в развитии растительно-микробныхвзаимодействий............................................................................................................................ 242.1. LysM-содержащие рецепторы узнают особый класс соединений, состоящих из остатковN-ацетилглюкозамина.

................................................................................................................ 242.2. Классификация LysM-содержащих рецепторов у растений. ........................................... 252.3. LysM-содержащие рецепторы - участники иммунного ответа у растений. ................... 272.4. LysM-содержащие рецепторы необходимы для развития симбиоза с грибамиарбускулярной микорзы и развитии бобово-ризобиального симбиоза..................................

312.4.1. Участие LysM-содержащих рецепторов в контроле развития симбиоза с грибамиарбускулярной микоризы. .................................................................................................. 312.4.2. Участие LysM-содержащих рецепторов в контроле развития симбиоза сризобиальными бактериями. .............................................................................................. 32Глава 2. Материалы и методы. ................................................................................................... 392.1. Штаммы микроорганизмов..................................................................................................

392.2. Условия культивирования микроорганизмов. ................................................................... 392.3. Растительный материал. ...................................................................................................... 402.4. Условия выращивания растений. ........................................................................................ 402.5. Олигонуклеотиды и ферменты. ........................................................................................... 402.6. Компьютерные и интернет-ресурсы.

.................................................................................. 412.7. Выделение ДНК растений. .................................................................................................. 412.8. Выделение РНК растений. ...................................................................................................

4132.9. Синтез комплементарной ДНК и количественная ПЦР, совмещенная с обратнойтранскрипцией (ОТ-ПЦР). .......................................................................................................... 422.10. Создание конструкций для трансформации растений и дрожжей. ............................... 432.11. Определение нуклеотидных последовательностей генов. ............................................. 482.12. Выделение ДНК бактерий. ................................................................................................ 482.13.

Приготовление электрокомпетентных клеток Agrobacterium........................................ 482.14. Временная трансформация листьев Nicotianabenthamiana. ........................................... 492.15. Выделение белков из листьев N. benthamiana, электрофорез белков в ПААГ и вестернблот гибридизация. ......................................................................................................................

492.16. Трансформация растений с помощью A. rhizogenes. .................................................... 502.17. Анализ взаимодействия белков с помощью дигибридной дрожжевой системы. ........ 512.17.1. Приготовление электрокомпетентных клеток дрожжей. .................................... 512.17.2. Приготовление селективных сред для анализа. ...................................................

522.17.3 Анализ колоний дрожжей с помощью ПЦР. ......................................................... 532.17.4. Анализ белок-белковых взаимодействий. ............................................................. 532.18. Поиск мутантных линий с помощью метода поиска индуцированных локальныхнарушений в геномах TILLING. ................................................................................................ 552.19.

Гистохимическая окраска и микроскопия. ...................................................................... 552.20. Статистическая обработка результатов. ........................................................................... 56Глава 3. Результаты и обсуждение. ...........................................................................................

573.1. Анализ экспрессии гена K1, кодирующего LysM-РПК, у гороха в процессе развитиясимбиоза с ризобиями с помощью количественной ОТ-ПЦР................................................. 573.2. Поиск мутантов гороха по гену k1 с помощью TILLING подхода, их генотипическая ифенотипическая характеристика. ............................................................................................... 583.2.1 Анализ регуляции выхода ризобий из инфекционных нитей у растений-мутантовпо гену к1. ............................................................................................................................. 683.3.

Анализ взаимодействия LysM-рецептор-подобных киназ K1, Sym10 и Sym37 гороха вразличных гетерологичных системах. ....................................................................................... 733.3.1. Трансформация листьев N. benthamiana с помощью A. tumefaciens длявременного синтеза белка.

.................................................................................................. 733.3.2. Анализ взаимодействий белков с помощью дрожжевой двугибриднойсистемы. ................................................................................................................................ 7743.4.

Сравнительный анализ роли рецепторов К1 и Sym37 у гороха при развитиисимбиоза. ...................................................................................................................................... 813.4.1.КомплементациягенаК1мутантойлинии817полноразмернойпоследовательностью этого гена исходной линии Cameor. ............................................

813.4.2. Коплементация линий K24 и RisNod4, несущих мутацию по гену sym37. ......... 83Заключение................................................................................................................................... 87Выводы ......................................................................................................................................... 92Список литературы ...................................................................................................................... 93Благодарности ............................................................................................................................

1125Условные обозначения и сокращенияLysM-РПК – LysM-содержащие рецептор-подобные киназыдпи – дни после инокуляцииОТ-ПЦР – полимеразная цепная реакция, совмещенная с обратной транскрипциейПЦР – полимеразная цепная реакцияДДС – дрожжевая дигибридная системаАМ – арбускулярная микориза6Введение.Изучение молекулярных механизмов восприятия клеткой внешних (первичных)сигналов и формирования функционального ответа является одной из основных задачбиологии. Проведение таких исследований связано с решением фундаментальных проблеми направлено, прежде всего, на лечение заболеваний, связанных с изменениями ввосприятии клетками внешних сигналов - диабет, сердечные заболевания, рак, болезньАльцгеймера (Pires-daSilva et al., 2003).Известно, что за узнавание сигналов в клетке отвечают различные типы рецепторов,которые активируют внутриклеточные мишени. Зачастую заболевания, сопряженные сизменением восприятия клеткой сигналов, связаны как с мутациями в самих рецепторах,так и с изменением их количества (Pires-daSilva et al., 2003).

Именно поэтому исследованияактивационных механизмов работы рецепторов лежат в основе современных биомедициныи фармакологии.Не только у животных, но и у растений восприятие клетками поступающих сигналовнеобходимо для их быстрой адаптации, что является залогом успешного существования.Растения ведут неподвижный образ жизни, поэтому им необходимо быстро реагировать наменяющиеся сигналы внешней среды. Неслучайно количество рецепторных киназ,основного типа рецепторов у растений, значительно превышает их количество у животных.Так у риса их обнаружено более 1000, у Arabidopsis более 600, в то время как количестворецепторных киназ, обнаруженных у человека, не превышает 70 (Haffaniet al., 2004).Идентификация и изучение рецепторов растений, и тем более понимание ихфункций значительно отстает от исследований, проведенных на млекопитающих имикроорганизмах. Часто единственным подходом для изучения рецепторов растенийявляется идентификация последовательностей кодирующих их генов только на основаниигомологии с известными генами рецепторов других организмов, при этом зачастую ихреальная функция в клетке и особенности регуляции остаются неизвестными.В связи с этим большой интерес может представлять изучение рецепторов растений,для которых известна функция лигандов.

Неслучайно первыми рецепторами, открытыми урастений, стали рецепторы к фитогормонам и регуляторным пептидам: рецепторы ETR кэтилену и рецептор BRI1 к брассиностероидам у Arabidopsis (Bleeckeret al., 1988; Chang etal., 1993; Hua et al. ,1995; Hua, Meyerowitz 1998; Sakai et al. 1998; Li, Chory 1997), рецепторы7к CLE-пептидам - CLAVATA1 и CLAVATA2 у Arabidopsis, необходимые для контроляпролиферации и дифференцировки клеток в меристемах растений (Trotochaud et al., 1999),рецептор SR160 к регулятору системного иммунного ответа – системину у томатаLycopersicon esculentum (Scheeret al., 2002).Среди сигнальных молекул, играющих важную роль в развитии взаимодействийрастений с микроорганизмами, особое значение имеют соединения, которые являютсяпроизводными хитина – хитоолигосахариды и липохитоолигосахариды.