Диссертация (Изучение роли рецептор-подобной киназы К1 гороха в контроле формирования симбиотических субклеточных структур), страница 9

truncatula мутантными штаммамиSinorhizobium meliloti – nodLEF- (изменена структура жирной кислоты у Nod-фактора и нетацетила на невосстанавливающем конце Nod-фактора), nodH- (нет сульфата навосстанавливающем конце Nod-фактора) была показана разная зависимость ответов состороны растения от структуры этих молекул. Было установлено, что развитие такихранних реакций, как деформации корневых волосков, деполяризация мембраны ивозникновение Ca2+-волн, начальные деления клеток коры корня, мало зависит отструктуры жирной кислоты Nod-фактора, но требует присутствия сульфата навосстанавливающем конце молекулы. Напротив, развитие инфекционного процесса и35органогенез клубенька зависят от наличия жирной кислоты и её структуры у Nod-фактора.На основании анализа этих результатов была предложена гипотеза о наличие двухрецепторов к Nod-факторам у бобовых растений этого типа, различающихся поспецифичности к структуре этих молекул и контролирующих разные этапы развитиясимбиоза.

Первый рецептор, получивший название «сигнальный» (от англ. signalingreceptor), необходим для активации ранних этапов развития симбиоза. Второй рецептор «рецептор проникновения» (от англ. entry receptor) необходим для развития инфекционныхнитей и дальнейших этапов органогенеза у люцерны (Ardourel et al., 1994).Анализ генома M.

truncatula позволил выявить кластер генов LYK1 – LYK7 в 5хромосоме, кодирующих семь LysM-РПК. Кроме того, в геноме этого растения быловыявлено еще три расположенных в разных хромосомах LYK гена – LYK8,LYK9 и LYK10.Структура кодируемых этими генами LysM-РПК (наличие LysM мотивов во внеклеточныхдоменах), позволила предположить, что среди них могут быть выявлены рецепторы к Nodфакторам, состоящим из остатков N-ацетиглюкозамина.Действительно, у M. truncatula был выявлен генMtLYK3, имеющий достаточновысокий уровень гомологии с геном LjNFR1 (Limpenset al., 2003; Smitet al., 2007). Вместес тем, при скрининге коллекции мутантов M.

truncatula также был выявлен еще одингенMtNFP, кодирующий LysM-РПК и имеющий высокий уровень гомологии с геномLjNFR5 (BenAmor et al., 2003; Arrighi et al., 2006; Zhang et al., 2007).Фенотический анализ мутантов М. truncatula по гену nfp показал, что у них такжекак и мутантов лядвенца по гену nfr5 отсутствуют ответные реакции на инокуляциюризобиями S. meliloti и обработку Nod-факторами (BenAmor et al., 2003). Однако в отличиеот мутантов лядвенца по гену nfr5, у мутантов М. truncatula по гену lyk3 (hcl-1, hcl-2, hcl-3)ранние симбиотические реакции развивались (деформации и скручивания корневыхволосков, формирование микроколоний ризобий), но нарушения затрагивали этапыразвития симбиоза, связанные с развитием инфекционного процесса (Limpens et al., 2003;Arrighi et al., 2006; Smit et al., 2007).

Наличие двух мутантов по генам LysM-РПК c с разнымфенотипическим проявлением соответствовало гипотезе о наличии у люцерны двухрецепторов к Nod-факторам, работающим на разных этапах развития симбиоза. Такимобразом, MtNFP и MtLYK3 стали возможными кандидатами на роль двух рецепторов к Nodфакторам у люцерны.Однако дальнейшее функциональное и структурное изучение выявленных LysMРПК MtNFP и MtLYK3 у люцерны показало, что рецепция Nod-факторов можетосуществляться еще более сложным образом, чем предполагалось ранее. Прежде всего,было установлено, что киназный домен рецептора MtNFP не способен к авто- и36трансфосфорилированию (Arrighi et al., 2006), что указывает на необходимостьвзаимодействия с другой LysM-РПК с функциональной киназой.

На основании изученияфенотипа мутанта по гену lyk3, маловероятно, что рецептор MtLYK3 может бытьнеобходим для инициации развития симбиоза (хотя нельзя не отметить, что наблюдаемыйфенотип мутанта lyk3, мог быть следствием наличия у люцерны других белков,функционально замещающих MtLYK3). Однако проведенные эксперименты по изучениюфункциональной заменяемости трех LysM мотивов во внеклеточном домене MtNFPдоменамиPsSym10указывалинаналичиедополнительногорецептора,взаимодействующего с MtNFP и необходимого для активации ранних симбиотическихреакций (таким рецептором не являлся MtLYK3) (Bensmihen, 2011).Более того, оказалось, что MtNFP и MtLYK3 М.

truncatula практически не связываютNod-факторы (Fliegmann et al.,2015). Наконец, изучение принципов работытрансмембранных рецепторов у растений и животных свидетельствует о том, чтонеобходимым условием их активации является олигомеризация - формирование гомо- илигетероолигомерных комплексов. Это позволяет предположить, что у люцерны приузнавании Nod-факторов могут формироваться несколько олигомерных комплексоврецепторов, контролирующих развитие ранних симбиотических реакций, а также болеепоздние этапы, связанные с инфекционным процессом и органогенезом клубенька.Это определяет необходимость поиска дополнительных рецепторов к Nodфакторам, которые входят в состав олигомерных комплексов и дальнейшего изученияпринципов организации таких рецепторов и их активации при передаче сигнала в клетку.Наконец, необходимо искать рецепторы, которые способны связывать Nod-факторы свысокой аффинностью.Недавно у люцерны была выявлена новая рецептор-подобная киназа MtLYR3, длякоторой была показана способность связывать Nod-факторы с высокой аффинностью, хотяэтот рецептор и не проявляет специфичности в узнавании структуры жирной кислоты(Fliegmann et al., 2013).

В связи с этим MtLYR3 может узнавать не только Nod-факторы, нои Мyc-факторы, выделяемые грибами АМ. Таким образом, остается неясным, принимаетлиMtLYR3 непосредственное участие в контроле развития бобово-ризобиального симбиозаили необходим для формирования микоризы с грибами АМ (Malkov et al., 2016).Горох P. sativum также как и люцерна формирует клубеньки недетерминированноготипа. Эксперименты с бактериальными мутантами показали, что гипотеза об участии двухрецепторов с разной специфичностью к структуре Nod-факторов и работающих на разныхэтапах развития симбиоза может быть состоятельной и для этого бобового растения.Однако в отличие от люцерны, у гороха не сам процесс инициации развития инфекционной37нити, а скорее ее развитие в клетках эпидермиса может быть строго специфичным поотношению к структуре Nod-фактора (наличию жирной кислоты C18:4 и ацетила наневосстанавливающем конце молекулы) (Spaink et al., 1991; Van Brussel et al., 1992; Walkerand Downie, 2000).У гороха выявлены два возможных кандидата на роль рецепторов к Nod-факторам,кодируемые генами PsSym10 иPsSym37 и являющиеся возможными гомологами геновLjNFR5 иLjNFR1, соответсвенно (Madsen et al., 2003, Zhukov et al., 2008).

Анализ мутантовпо гену sym10 (P5 (sym10-1), RisFixG (sym10-2), P56 (sym10-3), N15 (sym10-4)) показалполное блокирование ответных реакций при инокуляции ризобиями (Madsen et al., 2003). Умутантов по гену sym37 (RisNod4 и К24) были выявлены нарушения развитияинфекционных нитей на стадии их формирования в корневом волоске, тогда как ранниесимбиотическиереакции(скручиваниякорневыхволосковиформированиемикроколоний) у таких мутантов происходили (Borisov et al., 2000; Tsyganov et al., 2002;Zhukov et al.,2008). При этом у Sym10 киназный домен является не способным кфосфорилированию (Madsen et al., 2003), что указывает на необходимость взаимодействияс дополнительной рецепторной киназой, как и в случае с MtNFP.

Другой рецептор Sym37может быть необходим для контроля развития инфекции у гороха. Более того, опыты пообработке растений гороха мутантными штаммами ризобий (Li et al., 2011), выделяющимиNod-факторы только с одним типом жирной кислоты, показали, что способность различатьструктуру жирной кислоты этих сигнальных молекул зависит от рецепторной киназыSym37.Таким образом, у гороха актуальным является поиск дополнительных рецепторов кNod-факторам, которые входят в состав олигомерных комплексов и дальнейшее изучениепринципов организации таких рецепторов и их активации при передаче сигнала в клетку.В отличие от M.

truncatula, горох может быть более удобным объектом для поиска иизучения таких дополнительных рецепторов, поскольку у него выявлено несколькокандидатов на роль таких рецепторов.Ранее выполненные исследования по изучению сортов и линий гороха, имеющихафганское и иранское происхождение, показали их неспособность формировать симбиоз севропейскими штаммами R. leguminosarum bv.

viciae (Разумовская, 1931). В дальнейшембыло установлено, что штаммо-специфичный характер инокуляции таких сортов и линийгороха контролируется геном Sym2 (Lie, 1978; Geurts et al., 1997). Было установлено, чтоштаммы, способные заражать сорта и линии гороха афганского и иранскогопроисхождения, выделяют Nod-факторы с дополнительной ацетильной группой на38восстанавливающем конце этой молекулы.

Это позволило предположить, что PsSym2может кодировать рецептор к Nod-факторам и определило интерес к его идентификации.Кроме того, у гороха при скрининге библиотеки кДНК инокулированных корнейгороха при использовании в качестве зонда NFR1 лядвенца, был выявлены два генаимеющих высокий уровень сходства между собой – Sym37 и К1. Выявление мутантов погену sym37 позволило изучить роль кодируемой этим геном LysM-РПК в контроле развитиясимбиоза у гороха. Однако роль другой LysM-РПК, кодируемой геном К1, долгое времяоставалась неизученной из-за отсутствия мутантов по этому гену.В заключении следует отметить, что наличие у гороха нескольких новых кандидатовна роль рецепторов к Nod-факторам делает его удобной моделью для изучения рецепцииэтихсигнальныхклубенькообразования.молекулурастенийснедетерминированнымтипом39Глава 2.

Материалы и методы.2.1. Штаммы микроорганизмов.Для стандартных процедур клонирования использовали штамм Escherichia coliDH5α. Для инокуляции растений гороха был использован штамм Rhizobium leguminosarumbv. viciae CIAM 1026 (WDCM 966), а также меченый gusA (ген β-глюкуронидазы) штамм R.leguminosarum bv.