Диссертация (1145924), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Создание конструкций для трансформации растений и дрожжей.Для клонирования полноразмерной кодирующей последовательности гена PsK1 (безинтронов и стоп-кодона) использовали две пары праймеров для амплификации двухперекрывающихся фрагментов. Первый фрагмент (1-650 п.о.), содержащий внутреннийсайт для рестриктазы AccI, был амплифицирован методом ПЦР с помощью специфичных44праймеров K1_1_F_NheI_F и K1_650_R_EcoRI_R (Таблица 2) на матрице ДНК, выделеннойиз листьев гороха Finale.
Полученный фрагмент выделяли из геля с помощью наборакомпании Qiagen (США) по методике, предложенной производителем. Выделенныйфрагмент клонировали в вектор pMON, содержащий 35S-промотор вируса мозаики цветнойкапусты и терминатор нопалинсинтазы Tnos, по сайтам рестрикции NheI/ EcoR1 ссохранением рамки считывания с помощью T4 ДНК-лигазы. Второй фрагмент (418-1860п.о.) был амлифицирован на матрице кДНК Finale (клубеньки, 28 дней после инокуляции(дпи)), с помощью праймеров K1_418_F и K1_ R_EcoRI (Таблица 2). Полученный фрагментвыделяли из геля и клонировали в вектор pMON, содержащий фрагмент гена PsК1 1-650п.о., используя эндонуклеазы рестрикции AccI/ EcoRI. Проводили анализ полученныхконструкций.
После этого фрагмент, состоящий из промотора CaMV 35S, гена PsK1,слитого с красным флуоресцентным белком (red fluorescence protein, RFP) и терминатораTnos, переносили в плазмиду pBIN19 по сайтам рестрикции HindIII/ SmaI.В качестве контроля при исследовании белок-белковых взаимодействий в листьях N.benthamianaиспользовалиLRR-рецепторSYM19.Длясозданияконструкцийполноразмерную кодирующую последовательность гена PsSym19 без «стоп-кодона»амплифицировали на матрице кДНК с помощью праймеров (Таблица 2). Полученныйфрагмент выделяли из геля и клонировали в вектор pMON, используя эндонуклеазырестрикции NheI/ EcoRI. После этого кассету, состоящую из промотора CaMV 35S, генаPsSym19, слитого с белком желтой флюоресценции (yellow fluorescence protein, YFP) итерминатора Tnos переносили в плазмиду pBIN19 по сайтам рестрикции HindIII/ SmaI.Для клонирования гена K1 в векторе pB7WG2D использовали BP и LR клоназы(Invitrogen, США).
Для этого проводили амлификацию гена К1 на матрице вектораpMON::35S::K1-RFP::Tnos с использованием праймеров K1_F_TOPO и K1_R_TOPO (илиYFP_R). Полученный продукт выделяли из геля и клонировали в вектор pDONR221 (илиpENTR/D-TOPO) (Invitrogen, США) с использованием BP клоназы (Invitrogen, США) пометодике производителя. Затем ген переводили в вектор доставки pB7WG2D с помощьюLR клоназы (Invitrogen, США). Правильность полученной конструкции подтверждалисиквенированием.Для клонирования гена PsSym37 в векторе pB7WG2D проводили амплификациюполноразмернойкодирующейпоследовательностигенанаматрицевектораpMON::35S::Sym37-YFP::Tnos (создан Долгих Е.А.) с использованием праймеровSym37_F_TOPO и Sym37_R_TOPO (или YFP_R) (Таблица 3).
Дальнейшая схема полученияконструкции аналогична получению конструкции pB7WG2D::K1.45Для клонирования гена PsSym10 в вектор pB7WG2D на первом этапе работы получаликонструкцию в промежуточном векторе pENTRY/D-TOPO (Invitrogen, США) с помощьюLR клоназы. Для этого проводили амплификацию полноразмерной кодирующейпоследовательности гена PsSym10 на матрице pMON::35S::Sym10-YFP::Tnos (созданДолгих Е.А.) с использованием праймеров Sym10_attb1 и Sym10_attb2 (Таблица 3).Полученный фрагмент клонировали в вектор pENTRY/D-TOPO (Invitrogen, США) пометодике, предложенной производителем.
Дальнейшая схема получения конструкциианалогична получению конструкции pB7WG2D::K1.ДляклонированиямутантноговариантагенаPsк1,вкотороммутациясоответствовала таковой в линии 817, был использован метод сайт-направленногомутагенеза с помощью набора Site-Directed Mutagenesis (Thermo Fisher scientific, USA).Согласно рекомендациям производителя была подобрана пара праймеров (Таблица 3), в«прямом» праймере была введена необходимая замена.
Амплификацию проводили наплазмидеpDONR221::K,амплифицированныйпродуктвырезалиичистилиизгеля,проводили обработку полинуклеотидкиназой в течение 30 мин при +37 ºС, а затемсшивали лигазой в течение 30 минут при +25 ºС. Плазмиду вводили в клетки E.coliDH5α.После подтверждения наличия замены в последовательности Psк1, ген переводили в вектордоставки pB7WG2D с помощью LR клоназы (Invitrogen, США). Правильность полученнойконструкции подтверждали сиквенированием.Для изучения взаимодействий между белками в дрожжах был получен рядконструкций, содержащих последовательности, кодирующие внеклеточные доменыизучаемыхрецепторов.Доменнаяструктурабелковбылапроанализированасиспользованием данных сервера TMHММv.
2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHММ).Поскольку дигибриднаясистеманаосноветранскрипционногофактораGAL4предполагает изучение взаимодействия белков в ядре, последовательности, кодирующиесигнальные пептиды и трансмембранные домены, были исключены из полученныхконструкций. Для выявления последовательности сигнального пептида использовалиданные сервера SignalP - http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP. Таким образом, быликлонированы последовательности, кодирующие внеклеточные домены (extracellulardomain,ECD) рецепторов: SYM37-ECD с 22 по 223 аминокислоту, K1-ECD с 24 по 222аминокислоту, SYM10-ECD с 32 по 238 аминокислоту и AtCERK1-ECD с 25 по 233аминокислоту.
В качестве матриц для амплификации последовательностей, кодирующихвнеклеточные домены рецепторов K1, SYM37иSYM10, использовали уже готовыеконструкции в векторе pMON с полноразмерными кодирующими последовательностямиизучаемых генов. Для амплификации последовательности гена AtCERK1, кодирующей46ECD, использовали конструкцию pJET::CERK1 (ECD + трансмембранный домен), любезнопредоставленнуюDr. Julie Cullimore (Laboratory of Plant-Microbe Interactions, INRA, France).Праймеры для амплификации приведены в Таблице 4. После выделения из геля полученныхфрагментов проводили на них повторную амплификацию с помощью праймеров attb1_fullи attb2_full (Таблица 4), необходимых для клонирования в вектор pDONR221 (Invitrogen,USA) с помощью BP клоназы (Invitrogen, США). Переклонирование фрагментов из вектораpDONR221 в векторы pDEST22 (PREY) и pDEST32 (BAIT) осуществляли с помощью LRклоназы.Для изучения влияния мутаций, найденных у линий к1 817 и 2265, на взаимодействиес Sym10 был проведен анализ с помощью дрожжевой дигибридной системы.
При этомиспользовали конструкции, несущие мутантные копии гена К1, в которых мутациисоответствовали мутациям в линиях 817 и 2265.Конструкции были получены с помощьюнабора для сайт-направленного мутагенеза (Thermo Fisher Scientific, USA). Мутациявводилась в один из пары праймеров (Таблица 3), с помощью которых амплифицировалиплазмиду. В качестве исходной использовали плазмиду pDONR221::K1_ECD.
Послеамлификациилинеаризованнуюплазмидувырезалиизгеля,обрабатывалиполинуклеотидкиназой 30 минут при +37 ºС (Thermo Fisher Scientific, USA), а затемпроводили лигирование в течение получаса при комнатной температуре. Смесью длялигирования трансформировали клетки E.coli. Затем плазмиды выделялись и правильностьполученной конструкции подтверждали сиквенированием. Затем копию гена с мутациейпереводили в вектор доставки pDEST22 или pDEST32 с помощью LR клоназы (Invitrogen,США).Таблица2.Праймерыдляклонированияполноразмерныхкодирующихпоследовательностей генов PsK1 и PsSym19 в векторе pMON. Сайты рестрикцииподчеркнуты.Название праймераПоследовательность 5’ - 3’K1_1_F_NheI_FGGGCTAGCATGAAACTAAAAAATGGCTTACTCTTGK1_650_R_EcoRI_RGGGAATTCTCTCACTGACAATAGATTTATGAGK1_418_FCCTGCTAAGGCTAAGK1_R_EcoRIGGGAATTCTCTCACTGACAATAGATTTATSym19_NheI_FGGGGCTAGCATGATGGAGCTACGAGTTATTTGTATSym19_EcoRI_RGGGGAATTCTCTCGGTTGAGGGTGTGAC47Таблица3.Праймерыдляклонированияполноразмерныхкодирующихпоследовательностей генов PsSym10, PsSym37, PsK1 в векторе pB7WG2D.
Сайты дляузнавания BP и LR клоназами подчеркнуты.Название праймераПоследовательность 5’ - 3’K1_F_TOPOCACCATGAAACTAAAAAATGGCTTACTCK1_R_TOPOTCATCTCACTGACAATAGSym10_attb1GGAGATAGAACCATGGCTATCTTCTTTCTTCCTTCSym10_attb2AAGCTGGGTGTCAACGAGCTACTATAGAAGTAACAACASym37_F_TOPOCACCATGAAACTCAAAAATGGGTTACTGCSym37_R_TOPOTCATCTCACTGATAATAGATTTGTGYFP_RTCACTTGTACAGCTCGTCCATK1_817_FCCGTAGACCTTAACGAATAAGTAACAAACK1_817_RAGCCAGATTTCAAAAGATTATGGCTTТаблица 4.
Праймеры для амплификации последовательностей, кодирующихвнеклеточные домены PsSYM10, PsSYM37, PsK1, AtCERK1.Название праймераПоследовательность 5’ - 3’Sym10-EX_attb1_FGGAGATAGAACC AGTGGAACAAACTTTTCATGCCSym10-EX_attb2_RAAGCTGGGTGTCATTTTCTTCCATTTGAAGATGGTTGSym37-EX_attb1_FGGAGATAGAACC GGATCCAAGTGTGTAATAGGGSym37-EX_attb2_RAAGCTGGGTGTCATCTAGGATATAAAGGAACATAK1-EX_attb1_FGGAGATAGAACCAAGTGTGTGAAAGGGTGTGATK1-EX_attb2_RAAGCTGGGTGTCATTTAGGATACAAAGGAACATAAtCERK1-EX_attb1_FGGAGATAGAACCTGCAGGACTAGCTGTCCTTTAGCAtCERK1-EX_attb2_RAAGCTGGGTGTCATCCAGCACCAACACCATCTTGTattb1_fullGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCattb2_fullGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGK1_817_ex_FAGCCAGATTTCAAAAGATTATGGCTTK1_817_ex_RCCGTAGACCTTAACGAATAAGTAACAAAC48K1_2265_mut_FCTA TAA AAA ACT ATA TGC AAT CAAK1_2265_mut_RAAC ATT AGA AAA GTT TGT AAC TAT CTАмплификациюгеновпроводилиспомощьювысокоточнойполимеразыPhusionFlash методом ПЦР по следующей программе: 98oС - 10 сек; (далее 30 циклов): 98oС- 1 сек, температура отжига праймеров - 5 сек, 72oС - 30 сек.; 72 -1 мин.
Температуры отжигапраймеров подбирали в программе PrimerSelect. Полученные фрагменты выделяли из геля,а далее использовали для клонирования с помощью метода гомологичной рекомбинацииили обычного лигирования, затем трансформировали компетентные клетки E. coli DH5αпо методике, предложенной Inoue и соавт. (Inoue et al., 1990). Отбор трансформантовпроизводили на среде LB, содержащей соответствующий антибиотик.2.11. Определение нуклеотидных последовательностей генов.Анализ клонированных последовательностей генов, а также сохранность рамкисчитывания подтверждали путем определения нуклеотидной последовательности. Анализнуклеотидных последовательностей проводили по методу Сенджера на приборе CEQTM8000 GeneticAnalysisSystem (Beckman Coulter, США).2.12.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
