Диссертация (1145924), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Было проведено сравнение с уровнями экспрессии генов PsSym10 иPsSym37, кодирующими другие известные LysM-РПК, для которых ранее было ужепоказано участие в симбиозе (Madsen et al., 2003, Zhukov et al., 2008). Анализ показал, чтоэкспрессия гена PsK1 увеличивалась на ранних этапах развития симбиоза в 1,8 раза в ответна обработку ризобиями (2 дпи), но на дальнейших этапах уровень экспрессии гена малоизменялся по сравнению с контролем (неинокулированными корнями гороха на тех жесроках развития) (Рисунок 2). Однако несколько увеличенным уровень экспрессии гена K1был в клубеньках 14 дпи (в 1,5 раза) по сравнению с неинокулированными корнями.
Ранняяактивация K1 хорошо согласуется с тем фактом, что ген был впервые выделен избиблиотеки кДНК корней гороха на ранних стадиях после заражения (Franssen et al., 1987;Zhukov et al., 2008). Сходным образом уровень экспрессии PsSym10 начинал повышатьсяна 2 дпи (в 3,1 раза), достигая максимума на 4 дпи, а затем оставался достаточно высокимна последующих этапах развития симбиоза, а также в зрелом клубеньке (14 – 21 дпи).Экспрессия гена Sym37 также увеличивалась на ранних сроках после инокуляции в корняхгороха (начиная со 2 дпи, в 2,8 раза), однако наиболее существенно она возрастала на болеепозних этапах развития симбиоза, начиная с 5 дпи и достигая максимума в клубеньках (14дпи) по сравнению с контролем (неинокулированными корнями). Таким образом, все тригена K1, Sym10 и Sym37 показали повышенный уровень экспрессии на начальных этапахформирования симбиоза и в процессе развития клубеньков.
Следовательно, активация генаК1 может свидетельствовать о его вовлечении в контроль как ранних, так и более познихэтапов развития симбиоза.58Рисунок 2. Анализ экспрессии генов PsK1, PsSym10 и PsSym37 при инокуляции горохасорта Finale с помощью количественной ОТ-ПЦР. Были использованы корни иклубеньки гороха на 1, 2, 3, 5, 7, 9, 14, 21, 28 день после инокуляции (дпи) R. leguminosarumbv. viciae CIAM 1026, а также неинокулированные корни (контроль). Уровеньтранскрипции мРНК был нормализован относительно экспрессии генов убиквитина иактина. На рисунке представлены результаты одной из двух биологической повторностей.Бары представляют собой стандартные ошибки среднего трех аналитических повторностей.На оси ординат (Y) указаны значения отношения уровней экспрессии генов в варианте синокуляцией к контролю (варианте без инокуляции) (количество раз).3.2.
Поиск мутантов гороха по гену k1 с помощью TILLING подхода, ихгенотипическая и фенотипическая характеристика.(Подбор праймеров для поиска в коллекции TILLING мутантов, подбор условий работыпраймеров выполнен диссертантом самостоятельно. Фенотипическая и генотипическаяхарактеристика мутантных линий выполнена под руководством внс Долгих Е.А.)Поиск мутантов по гену к1 был проведен с помощью TILLING подхода (от англ.Targeting Induced Local Lesions in Genomes – поиск индуцированных локальных нарушенийв геномах) на базе института геномных исследований растений (Group of Plant GenomicsResearch, URGV, INRA, France) (Dalmais et al., 2008). Поиск проводили для 4 фрагментовгена (размером около 400 п.о.). Проведенный анализ позволил обнаружить 17 мутантных59линий (Таблица 5). In silico анализ с помощью программы SIFT позволил предсказатьвлияние мутаций в гене на функцию кодируемого белка (Ng et al., 2003).Таблица 5.
Результаты TILLING анализа.С помощью программы SIFT среди 17 мутантных линий были выявлены 3 линии(817, 885 и 2265), у которых миссенс-мутации могли приводить к нарушению функциибелка (Таблица 6).Особый интерес для нас представляла линия 885, у которой в результате мутациипроисходила замена нуклеотида G → A по положению1445 (таблица 6), что приводило кизменению аминокислоты глицина на аспартат (Gly332Asp) в достаточно важном длявыполняемой функции участке рецептора – нуклеотид-связывающем мотиве киназногодомена. Такая замена могла приводить к полному «выключению» функции белкарецептора, то есть к его неспособности передавать сигнал после активации в клетку.Cходным образом у мутанта B56 (hcl-1) M.
truncatula (мутант по гену lyk3) заменааминокислоты по достаточно близкому положению (Gly334Glu) в активационной петлекиназного домена приводила к существенному нарушению функции белка (Smit et al.,2007).У другой линии 817 в результате мутации происходила замена нуклеотида C → T поположению 571 (таблица 6), что приводило к изменению аминокислоты пролина на серин60(Pro169Ser) в LysM3 мотиве внеклеточного домена.
Это непосредственно моглооказывать влияние на конформационную структуру этого мотива и, возможно, структурувсего внеклеточного домена.Наконец, у линии 2265 в результате замены нуклеотида C → T по положению 242(таблица 6) происходила замена аминокислоты серина на фенилаланин (Ser59Phe) вLysM1 мотиве внеклеточного домена, что также могло оказывать влияние на конформациюданного участка во внеклеточном домене рецептора К1.Для фенотипической характеристики мутантных линий 817, 885 и 2265 проводилианализ формирования у них клубеньков на корнях при инокуляции R. leguminosarumbv.viciae CIAM 1026-gusA на 21 дпи.Таблица 6.
Генотипическая характеристика мутантов по гену k1.ЛинияМутацияПозиция вДНКПозиция вбелке,Расположениезамена а/к817C→T571Pro169SerLysM3 мотив ECD885G→A1445Gly332AspКиназный домен2265C→T242Ser59PheLysM1 мотив ECDУ двух линий 885 и 817 нами не было выявлено клубеньков на корнях в ответ наинокуляцию (Nod- фенотип). У мутантной линии 2265 на 14 дпи общее количествоклубеньков было сравнимо с количеством клубеньков у растений дикого типа (38,7 ± 3,1 на1 растение у линии 2265 и 41,7 ± 5,2 у дикого типа), однако, только часть из них (22,3 ± 3,7)была инфицирована или находилась на начальной стадии заражения (Рисунок 5 Б). На 21дпи число зараженных клубеньков было сравнимо с числом таких клубеньков у растенийдикого типа (43±0,97 на 1 растение у линии 2265 и 46,57±1,23 у дикого типа; P<0,05, по tкритерию Стьюдента), структура таких клубеньков не отличалась от структуры клубенькову растений дикого типа (Рисунок 5 Г, Д).Анализ корней 885 линии показал полное отсутствие реакций на инокуляциюризобиями (Nod- фенотип) – мы наблюдали только редкие деформации корневых волосков(Рисунок 3).
Кроме того, с очень низкой частотой в корнях мутанта образовывалиськороткие абортивные инфекционные нити, связанные с маленькими скрученнымикорневыми волосками (Таблица 7), развитие которых останавливалось в эпидермисе(Рисунок 3).61Рисунок 3. Фенотипический анализ мутантной линии 885 по гену к1.А – внешний вид растений линии 885, инокулированных R. leguminosarum bv. viciae CIAM1026-gusA на 21 дпи (Nod- фенотип). Б – внешний вид корневых волосков без деформаций.В – редкие ветвления корневых волосков. Г, Д – формирование абортивных инфекционныхнитей, связанных с маленькими корневыми волосками.Шкала - Б – 200мкм, В, Г, Д - 50 мкм.
ИН – инфекционная нить, белой стрелкой показановетвление корневого волоска.Таблица 7. Деформации, скручивания корневых волосков и рост инфекционныхнитей у дикого типа Cameor и 885 мутантной линии.ВариантДикий типCameorДеформации искручивания корневыхволосковРост инфекционныхнитейКоличествоклубеньков301,7 ± 13,418, 3 ± 2,846,57±1,2885 линия4,8 ± 1,32,8 ± 0,9*0817 линия125,2 ±11,2142,2 ± 4,7(101,8 ± 6,6) **0P56 линия1,45±0,4600Данные представляют число (± SEM) деформированных и скрученных волосков, а такжеколичество инфекционных нитей на 21 дпи на 100 полей зрения микроскопа (20хувеличение).
Различия между мутантной линией и растениями дикого типа достоверны (P> 0,95). *Были выявлены только абортированные инфекционные нити в маленьких62корневых волосках (Nod-- фенотип). ** Развитие большинства выявленных инфекционныхнитей были абортировано в эпидермисе. Линия P56(мутантпогенуsym10)былаиспользована в качестве контроля при работе с R. leguminosarum bv.
viciae CIAM 1026-gusA.Анализ корней линии 817 показал развитие ранних симбиотических реакций –скручивание корневых волосков и формирование инфекционных нитей. У линии 817мутация в гене к1 приводила к нарушению развития инфекционных нитей: нарушаласьполярность их роста, поэтому они часто имели sac-подобное строение (от англ.
sac –мешок). У данной линии наблюдали формирование примордиев клубеньков, однако ониоставались неинфицированными из-за отсутствия выхода бактерий из инфекционных нитей(Рисунок 4.II). На рисунке 5.II.Б представлена инфекционная нить, при этом выходбактерий из инфекционных нитей отсутствует. Для гистохимического окрашивания былииспользованы антитела MAC57 (против компонентов клеточной стенки бактерий) иантитела MAC265 против инфекционных нитей и капель. Использование данных антител,а также окрашивание йодистым пропидием (окрашивает бактериальные и растительныеядра), позволило выявить блокировку выхода бактерий из инфекционных нитей (Рисунок4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
