Диссертация (1145924), страница 15

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 15)

II Б, В).63Рисунок 4. Фенотипический анализ мутантной линии 817 по гену k1. I.Микроскопический анализ 817 линии. А – внешний вид корней мутантной линии 817,инокулированных R. leguminosarum bv. viciae CIAM 1026-gusA на 21 дпи (Nod- фенотип), Б- скрученный корневой волосок с растущей инфекционной sac-подобной нитью, В, Г –продольный агарозный срез (50 мкм) корня, формирование примордия клубенька на 21 дпи,Д - агарозный срез (50 мкм), рост sac-подобной ИН без выхода бактерий. Шкалы - Б, В - 50мкм, Г, Д – 100 мкм II.

Гистохимический анализ 817 линии. А – инфекционная нить иотсутствие выхода бактерий из инфекционных нитей и инфекционных капель (бактерии иядра синие), белыми стрелками отмечены инфекционные нити, инфекционные капли и ядрарастительных клеток, Б, В – Инфекционная нить и отсутствие выхода бактерий изинфекционной нити (нить – желтая, бактерии – зеленые). (Г) – 3D реконструкцияинфекционной нити (бактерии и ядра растительных клеток голубые) показала отсутствиевыхода бактерий из ИН (белыми стрелками отмечены ИН и инфекцинная капля), Д – ИН иотсутствие выхода бактерий из ИН Шкалы - A - 20 мкм, Б, В - 10 мкм, Г, Д – 20 мкм. ПК –64примордий клубенька, ИН - инфекционная нить, ИК – инфекционная капля, РЯ –растительное ядро.У мутантной линии 2265 выявлены нарушения в развитии инфекционногопроцесса.

Анализ показал нарушение развития инфекционных нитей из-за измененияполярности роста (Рис. 5A). Это приводило к значительной задержке развития инфекциина 14 дпи - снижению количества зараженных клубеньков и увеличенному по сравнению сдиким типом количеством инфекционных нитей (322 ± 25,1 на растение у линии 2265 и115,8 ± 12,3 у дикого типа) на 14 дпи.Рисунок 5. Фенотипический анализ мутантной линии 2265 по гену k1. А – продольныйагарозный срез (50 мкм) корня растения мутантной линии 2265 на 14 дпи, формированиеклубенькового примордия и развитие sac-подобной инфекционной нити, Б – развитиеинфицированного клубенька на растении мутантной линии 2265 на 14 дпи gusA-меченымиризобиями, В – внешний вид корней мутантной линии 2265, инокулированной R.leguminosarum bv.

viciae CIAM 1026-gusA на 21 дпи, Г - продольный срез клубенька (60 μm)растений мутантной линии 2265, инокулированных gusA-мечеными ризобиями, на 21 дпи,Д - продольный срез клубенька (60 мкм) растений исходной линии Cameo,инокулированных gusA-мечеными ризобиями, на 21 дпи. ИнК – инфицированные клетки.ИН – инфекционные нити.

Шкалы - A, Б – 50 мкм, Г, Д -100 мкм.65Таким образом, в результате проведенного анализа были выявлены 3 различныемутантные линии по гену к1, при этом у двух линий мутации приводили к нарушениюразвития клубеньков (Nod- фенотип). Это подтверждает гипотезу об участии К1 в развитиисимбиоза гороха с ризобиальными бактериями.Мутация в гене к1 у 885 линии приводит к наиболее сильно выраженнымнарушениям развития симбиоза (практически полному блокированию развития симбиоза вответ на инокуляцию). Мутация влияет на замену аминокислоты в киназном доменеGly332Asp.

Интересно отметить, что мутация в очень близкой области (Gly334Glu)наблюдается у линии B56 (hcl-1) M. truncatula, мутантной по гомологичному гену lyk3,которая приводит к замене аминокислоты в активационной петле киназного домена LysMРПК MtLYK3. Мутация находится в участке, ответственном за связывание молекулы АТФпри фосфорилировании (Smit et al., 2007). Однако у мутанта hcl-1, в отличие от мутантнойлинии 885 гороха, развиваются реакции в ответ на инокуляцию ризобиями – происходятмножественные скручивания корневых волосков (Catoira et al., 2001).У гороха высокую гомологию с геном PsK1 имеет ген PsSym37 (86% идентичностипо нуклеотидной последовательности).

Ранее были охарактеризованы две мутантные линиигороха RisNod4 и K24 по гену sym37, несущие мутации, приводящие к заменам вовнеклеточном и киназном доменах, соответственно (Tsyganov et al., 2002; Zhukov et al.,2008). Обе линии не формируют на корнях клубеньков (Nod- фенотип), однако ранниереакции у них развиваются – скручивание корневых волосков и формированиемикроколоний (Tsyganov et al., 2002; Zhukov et al., 2008).

Таким образом, блокированиесимбиотических реакций у мутанта 885 происходит на более ранних стадиях, чем умутантов B56 (hcl-1), RisNod4 (sym37-1) и K24 (sym37-2), что позволяет сделать вывод отом, что LysM-РПК К1 контролирует более ранние стадии развития симбиоза, чем PsSym37и MtLYK3.Фенотип 885 мутантной линии схож с фенотипом мутанта Ljnfr1, у которогополностью отсутствуют реакции на инокуляцию ризобиями (Radutoiu et al., 2003).

Однакоу 885 линии с низкой частотой мы наблюдали формирование коротких абортированныхинфекционных нитей, при этом развитие таких нитей было связано только с маленькимидеформированными корневыми волосками и останавливалось в эпидермисе. Выполненныеранее эксперименты по анализу растений гороха, инокулированных бактериальныммутантом nodABCIJ- (данный штамм ризобий не синтезирует Nod-факторы) наблюдалипроникновение ризобий в основание корневых волосков (Walker, Downie, 2000). Однакооставалось неясным, связано ли появление не выделяющих Nod-факторы ризобий в клеткахэпидермиса с их проникновением через разрывы в эпидермисе, как это было показано66недавно для штаммов ризобий, заражающих L. japonicus (Madsen et al.,2010), илипроисходило развитие внутриклеточной инфекции с помощью инфекционных нитей.Вероятно, менее строгая зависимость проникновения ризобий в клетки эпидермиса корняу гороха может определять небольшие фенотипические различия между 885 мутантнойлинией и мутантом лядвенца по гену nfr1.У линии 817, несущей мутацию в гене к1, которая приводит к замене аминокислотыв LysM3 мотиве внеклеточного домена, отсутствовали клубеньки при инокуляции инарушалсяполярныйростинфекционныхнитей(формировалисьsac-подобныеинфекционные нити).

Ранее при компьютерном моделировании связывания К1 c NodRlvV,Ac, C18:42,4,6,11, было показано, что восстанавливающий конец молекулы лигандарасположен в LysM3 мотиве рецептора (Долгих, 2017). Именно здесь находится заменаPro169Ser у мутантной линии 817, что подтверждает важность этой аминокислоты дляструктуры LysM3 мотива и, возможно, всего внеклеточного домена, при связывании Nodфактора.

Следовательно, данные проведенных компьютерных расчетов о важностиопределенных аминокислот для связывания Nod-фактора хорошо согласуются срезультатамифенотипическойхарактеристикимутантов,выполненныхвнашихэкспериментах. Другим возможным объяснением может быть то, что данная аминокислотаявляется необходимой для формирования гетероолигомерного комплекса с ко-рецепторомK1.Сходный фенотип был описан у мутанта hcl-4 M. truncatula по гену lyk3, у которого врезультате нарушения сплайсинга образуется укороченная форма белка LYK3 (Smith et al.,2007). У этого мутанта наблюдаются скручивания корневых волосков и образуютсямикроколонии S.

meliloti. Однако, как и у 817 линии, после инициации формированияинфекционных нитей, они формируют sac-подобные структуры, заполненные бактериямиS. meliloti. Следует отметить, что в 8,2% случаев линия hcl-4 способна формироватьнормальные клубеньки, но у линии гороха 817 такая способность полностью отсутствуетиз-за блокирования выхода бактерий из инфекционных нитей. Этот факт указывает навозможное участие К1 не только в начальных стадиях развития симбиоза, но и в контролеразвития инфекционной нити в коре корня гороха и эндоцитозе бактерий из инфекционныхнитей.Для подтверждения нарушения развития симбоза у мутантных линий по гену к1 былизмерен уровень экспрессии генов- маркеров развития симбиоза.

В качестве маркеров быливыбраны – ген NIN (от англ. Nodule Inception – начало клубенькообразования), кодирующийтранскрипционный фактор и необходимый для иницациация развития симбиоза и болеепоздних стадий органогенеза (Schauser et al., 1999; Borisov et al., 2003; Marsh et al., 2007;67Oldroyd и Downie 2008); гены ENOD5 и ENOD12a (от англ.early nodulin – ранний нодулин),кодирующие нодулины и контролирующее как ранние стадии развития симбиоаза, так иразвитие инфекции (Scheres et al., 1990a, б; Dolgikh et al., 2011); Sym37 – LysM-РПК,которая играет важную роль в регуляции развития инфекционных нитей и клубеньков(Zhukov et al., 2008)Рисунок 6.

Анализ экспрессии Enod5, Enod12 и NIN генов - маркеров развитиясимбиоза при инокуляции гороха исходного сорта Cameor и мутантых линий по генук1 в корнях и клубеньках с помощью количественной ОТ-ПЦР на 14 день послеинокуляции ризобиями.68Анализ показал существенное снижение уровня экспрессии генов-маркеровразвития симбиоза у мутантных по гену к1 линий на 14 день после инокуляции ризобиями.У 885 линии экспрессия генов-маркеров отсутствовала, что сопоставимо с даннымифенотипического анализа. У линии 817 происходит значительное снижение уровняэкспрессии генов-маркеров по сравнению с диким типом, так экспрессия NIN снижается в27 раз, ENOD5 в 24 раз, ENOD12 в 12 раз. Значительное снижение уровня экпсрессии этихмаркеров (но не полное их отсутствие) объясняется развитием ранних симбиотическихреакций у растений данной мутантной линии – формирование инфекционных нитей иразвитие незараженных примордиев.

У линии 2265, показывающей лишь задержку вразвитии симбиоза, данные маркеры экспрессируются также на сниженном уровне, однакоболее высоком, чем у линии 817. NIN снижается в 5 раз, ENOD5 – в 10 раз, ENOD12 - в 1,5раза.3.2.1 Анализ регуляции выхода ризобий из инфекционных нитей у растениймутантов по гену к1.Фенотипическая характеристика мутантной линии 817 позволила выдвинутьпредположение, что К1 способен контролировать не только ранние реакции развитиясимбиоза, но также и более поздние – выход бактерий из инфекционных нитей. Впервыеудалось продемонстрировать зависимость процесса экзоцитоза бактерий из инфекционныхнитей от LysM-РПК, что делает рецептор К1 уникальным.

Большой интерес представляетвыяснение вопроса о том, как именно К1 способен контролировать данный процесс.У модельного бобового M. truncatula, а также у гороха описан ряд мутантов, укоторых также, как и у 817 линии, нарушен процесс выхода бактерий из инфекционныхнитей.

Характеристики

Список файлов диссертации