Диссертация (1145924), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Все растворы стерилизовали фильтрацией с помощьюшприцевых фильтров (0,2 мкм, Macherey Nagel, Германия).10-кратная азотная основа для селективных сред (без аминокислот) (от англ. yeastnitrogen base, YNB, (Sigma, Германия) содержала 13, 4 г сухого вещества в воде (готовилипри перемешивании и подогреве в течение 2 часов). Добавляли 20% (10х) сахарозу, 2, 67 %агара. На чашку Петри объемом 30 мл добавляли 250 мкл раствора 100 мМ гистидина и 250мкл 20 мМ урацила (Sigma, Германия). Сухое вещество растворяли в воде на водяной банепри температуре +40 ºC в течение 30 мин.Для добавления также использовали 1М аминотриазол (3AT) (Вектон, Россия).Сухое вещество растворяли при перемешивании и подогреве в течение 2 часов.
На чашкуПетри объемом 30 мл добавляли в зависимости от селекции: 100 мМ 3AT – 3 мл , 50 мМ3AT – 1,5 мл, 25 мМ – 750 мкл, 10 мМ – 300 мкл.Кроме того, добавяли 1% 5-фтороротовую кислоту (5-ФОА) (Sigma, Германия).Сухое вещество растворяли в воде в течение 3 часов при температуре +50ºC. На чашкуПетри объемом 3 мл добавляли 600 мкл раствора (до конечной концентрации 0,2%).Использовали 40 мМ триптофан (480 мкл раствора на 30 мл), 100 мМ лейцин (250 мклраствора на 30 мл), 0,7 мМ (100х) аденин.Для приготовления I стока аминокислот – аланин, аргинин, аспаргин, цистеин,изолейцин, лизин, фенилаланин, пролин, серин, треонин (Sigma, Германия).
Брали по 0,3 г53каждой аминикслоты и растворяли смесь в 100 мл воды. На чашку Петри объемом 30 млдобавляли 300 мкл раствора.II сток аминокислот – глутаминовая кислота, глутамин, тирозин, валин. Брали по 0,3г каждой аминикслоты, добавляли 80 мл воды и добавляли 5N NaOH до полногорастворения осадка.
На чашку Петри объемом 30 мл добавляли 300 мкл раствора.III сток аминокислот – аспарагиновая кислота, глицин, метионин. Брали по 0,3 гкаждой аминикслоты, добавляли 80 мл воды и добавляли концентрированную солянуюкислоту до полного растворения осадка. На чашку Петри объемом 30 мл добавляли 300 мклраствора.На 100 мл среды в стерильной посуде смешивали по 10 мл YNB и глюкозы, растворыаминокислот, необходимые селективные агенты, доводили объем расплавленным агаром(температура +50 - +60 ºC, конечная концентрация 1%). Разливали в чашки Петри.2.17.3 Анализ колоний дрожжей с помощью ПЦР.Для подтверждения наличия плазмиды в клетках дрожжей проводили ПЦР колонийс помощью праймеров для амплификации последовательности, кодирующей внеклеточныйдомен белков.
Для этого колонию дрожжей с помощью стерильной зубочистки переносилив микробирку с 10 мкл воды, вносили 10U летиказы из Arthrobacter luteus (Sigma, Германия)инкубировали +37 ºC на водяной бане, затем пробирки помещали в морозилку на -80 ºC на10 мин, снова инкубировали 10 мин при +37 ºC, а затем снова на -80 ºC на 10 минут. Послеэтого 1 мкл из полученной смеси использовали как матрицу для проведения ПЦР.2.17.4.
Анализ белок-белковых взаимодействий.Конструкции, содержащие последовательности, кодирующие внеклеточные доменыисследуемыхбелков,поэтапновводиливэлектрокомпетентныеклетки.Электротрансформацию проводили с помощью прибора Gene Pulser Xcell (Bio-Rad, США),для трансформации использовали 600-900 нг плазмиды. После трансформации клеткиресуспендировали в 400 мкл 0,9% NaCl и высаживали на селективную чашку, растираямикробиологическимшпателемДригальскогодополноговысыхания.Послетрансформации плазмидами pDEST22 клетки высаживали на селективную среду SCтриптофан + лейцин + гистидин + урацил + аденин. После трансформации плазмидамиpDEST32 клетки высаживали на селективную среду SC- лейцин + триптофан + гистидин +54урацил + аденин.
Чашки инкубировали в термошкафу +28 ºC до появления колоний.Наличие плазмид проверяли методом ПЦР с колоний.Для введения второй плазмиды, колонию с подтвержденной вставкой использовалидля приготовления компетентных клеток. После электротрансформации дрожживысаживали на среду SC- триптофан – лейцин + гистидин + урацил + аденин. Послепоявления колоний проводили анализ взаимодействия на селективных средах методомреплик. В качестве контроля использовали три типа взаимодействий предложенныхпроизводителем (Invitrogen, США). Дрожжевые колонии штрихами пересевали на чашку сосредами SC-триптофан – лейцин + гистидин + урацил + аденин вместе со штрихамидрожжевых колоний, содержащих контрольные плазмиды. Чашку инкубировали втермошкафу двое суток при +28 ºC, затем с помощью метода реплик пересаживали колониина селективные чашки:SC- триптофан – лейцин – гистидин – урацил + аденинSC- триптофан – лейцин – гистидин – урацил + аденин + (100 мМ/ 50 мМ /25 мМ/ 10 мМ)3АТКолонии так же высевали на чашки с SC-триптофан-лейцин-гистидин + урацил +аденин + 0,2% 5-ФОА.
Чашки инкубировали 2 суток в термошкафу при +28 ºC.Исследуемые пары представлены в таблице 5.Таблица 5. Пары исследуемых белков.pDEST32pDEST22Sym10-ECDК1-ECDSym10-ECDSym37-ECDSym10-ECDCERK1-ECDSym37-ECDSym37-ECDК1-ECDCERK1-ECDSym37-ECDCERK1-ECDSym10-ECDК1-ECD-mut817Sym10-ECDК1-ECD-mut2265552.18. Поиск мутантных линий с помощью метода поиска индуцированныхлокальных нарушений в геномах TILLING.Фенотипическая характеристика мутантов по определенному гену позволяет судитьо возможной биологической роли кодируемого белка. Поиск мутантов по гену k1 былосуществлен с помощью методики TILLING(от англ.
Targeting Induced Local Lesions inGenomes — поиск индуцированных локальных нарушений в геномах). Метод сочетает всебе стандартный и эффективный метод мутагенеза с использованием химическихмутагенов, таких, как этилметансульфоната (ЭМС) с чувствительным методом анализаДНК, который определяет единичную мутацию (точечные мутации) в исследуемом гене.Анализ проведен на TILLING платформе группы исследования геномики растений (URGV,INRA, Франция) на основе линии Cameor. Поиск мутации был осуществлен по 4фрагментам гена PsК1. Влияние мутаций на изменения в аминокислотном составекодируемого белка, которые могут повлиять на его функцию, были предсказаны с помощьюпрограммы SIFT.
Мутантные линии были получены в M4 или M5 поколениях и проверенына гомозиготность по гену PsK1. Для этого проводили амплификацию фрагмента гена,используяпраймерыдляTILLING-амплификации,затемпроводилианализпоследовательностей полученных фрагментов. После проращивания и инокуляции R.leguminosarum bv. viciae 1026, мечеными gusA, проводили анализ на 28 дпи. В качествеконтроля использовали исходную линию Cameor.2.19. Гистохимическая окраска и микроскопия.Для визуализации инфекционных нитей и клубеньков, корни гороха и клубенькимутантных линий гороха 817, 885 и 2265 по гену k1 были собраны на 28 день послеинокуляции ризобиями и окрашены в растворе 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-Dглюкуронида (X-Gluc) (ThermoScientific, США) (0,2 M Na2PO4 (pH7.0), 0,5 M ЭДТА (pH8.0), 20 мМ K-феррицианид, 20 мМ K- ферроцианид, 20 мМ5-бромо-4-хлоро-3-индолилбета-D-глюкуроновая кислота, циклогексиламмониевая соль (X-Gluc), 0,01% тритон X100).
Растительные ткани были инкубированы в растворе в течение ночи при +37°C.Окрашенные клубеньки и корни были фиксированы в свежеприготовленном растворе дляфиксации (3% параформальдегид, 0, 25% глютаровый альдегид, 0,3% Твин-20, 0,3% тритонX-100), приготовленном на фосфатном буфере (0,14 MNaCl, 2,7 мМ KCl, 6,5 мМ Na2HPO4и 5 мМ KH2PO4, pH 7, 3) (Voroshilova et al., 2009). Для оптимального проникновенияфиксатора проводили дегазацию растительных тканей в течение 7 мин при 0.9 бар 5 раз56(Kitaeva et al., 2015).
Фиксацию проводили в течение ночи при +4°C. Фрагменты корнейбыли три раза по 20 мин промыты в фосфатном буфере (pH=7,3). Затем фрагментыпомещали в расплавленную 3% агарозу в чашке Петри диаметром 3 см. После остывания иполимеризации агарозы блоки с фрагментами корней вырезали из чашки и фиксировали надержателе образца с помощью клея «Момент».
Резку проводили с помощью микротома свибрирующим лезвием HM650V (Microm, Walldorf, ФРГ) при следующих параметрах:толщина среза – 60 мкм, амплитуда – 0, 6 мм, частота – 80, скорость резки – 10. Полученныеcрезы помещали на предметные стекла для световой микроскопии, наносили 100 мклдистиллированной воды и накрывали покровным стеклом. Фотографии делали намикроскопе с помощью камеры Axiocam 506 Color.Для визуализации бактерий у мутантной линии 817 использовали антитела МAC57(Brewin et al., 1986) против компонентов клеточной стенки ризобий, а для визаулизацииинфекционных нитей и инфеционных капель использовали антитела MAC265 (VandenBosch et al., 1989; Tsyganova et al., 2009). Для этого, полученные на вибротоме срезы,блокировали в течение часа в растворе 5% БСА, 0,5% козьей сыворотки, 0,2% рыбьегожелатина, затем срезы инкубировали в 1% БСА с антителами М57, полученными в мышах,в разведении (1:100) в течение ночи при + 4°C.
Срезы были промыты 6 раз по 10 мин иинкубированы в 5% БСА 25 мин при +28°C. Затем срезы были инкубированы со вторымиантителами, конъюгированными с AlexaFluor 488,(Thermo Fisher Scientific, США) вразведении 1 : 500 в течение 90 мин при +28°C. Срезы были промыты 3 раза по 10 мин вфосфатном буфере и заключены в ProLongGold (Thermo Scientific, США). Срезы былипроанализированы с помощью лазерной сканирующей конфокальной системы LSM 510META (CarlZeiss, Германия).2.20. Статистическая обработка результатов.Опыты проводили в двух-трехкратной биологической повторности.
Статистическуюобработку результатов проводили с помощью критерия Стьюдента в программе MicrosoftOffice Excel. Различия считались статистически значимыми при уровне р≤ 0,05.57Глава 3. Результаты и обсуждение.3.1. Анализ экспрессии гена K1, кодирующего LysM-РПК, у гороха в процессеразвития симбиоза с ризобиями с помощью количественной ОТ-ПЦР.Для изучения роли LysM-РПК К1 в процессе развития симбиоза, был оценен уровеньэкспрессии кодирующего ее гена PsK1 в ответ на инокуляцию R. leguminosarum bv. viciaeCIAM1026, начиная с 1 до 28 день после инокуляции (дпи), с помощью количественной ОТПЦР (Рисунок 2).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
