Диссертация (1145924), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Выделение ДНК бактерий.Плазмидную ДНК E. coli выделяли из 3 мл ночной культуры клеток методомщелочного лизиса (Birnboim, Doly, 1979) или с помощью коммерческих наборов длявыделения плазмидных ДНК QIAGEN или Silica. Выделенные плазмиды вводили в клеткиDH5α методом химической трансформации (Inoue et al., 1990).2.13. Приготовление электрокомпетентных клеток Agrobacterium.Штамм агробактерий высевали на чашку с TY, выращивали двое суток при 28ºC.
В3 мл жидкой среды TY (без CaCl2) вносили одну колонию с чашки, инкубировали ночь нашейкере 220 об/мин при 28ºC. В 100 мл среды TY (без CaCl2) вносили 1 мл ночной культурыи выращивали при +28 ºC до OD600=0.6-0.8. Затем культуру охлаждали на льду 30 минут,переносили в центрифужные стаканы и откручивали при 3500 об/мин, 15 мин, +4 ºC.
Далеевсе манипуляции проводили строго на льду. Среду сливали и ресуспендировали осадок в100 мл стерильной холодной деионизированной воды. Затем центрифугировали при 3500об/мин, 15 мин, +4 ºC. Воду сливали и ресуспендировали осадок в 50 мл стерильной49холодной деионизированной воды. Снова центрифугировали при 3500 об/мин, 15 минут, +4ºC.
Удаляли воду и ресуспендировали осадок в 20 мл глицерола (8,7%, готовили надеионизированной воде). Далее центрифугировали при 3500 об/мин, 15 мин, +4 ºC.Глицерол удаляли и ресуспендировали осадок в 200 мкл холодного 8.7% глицерола.Полученные клетки фасовали по 40 мкл, замораживали в жидком азоте и хранили при -80ºC.2.14. Временная трансформация листьев Nicotianabenthamiana.Штаммы A. Tumefaciens LBA 4404 или GV3101::pMP90 (RK), несущие векторы дляэкспрессии полноразмерных генов, кодирующих LysM-РПК, были использованы дляинфильтрации в листья N.
benthamiana. Бактериальные культуры выращивали в жидкойсреде TY при 28ºC в течение ночи. Затем культуры откручивали при 3000 об/мин иресуспендировали в буфере (10 мМ MES-KOH, 10 мМ MgCl2 и 0.5 мМ ацетосирингон) доплотности культуры OD600 = 0.5. Для трансформации брали нижние листья (2-3 лист отземли). Иголкой от инсулинового шприца делали небольшой прокол в листьях. В шприцнабирали бактериальные культуры и, прижимая к месту прокола, вводили бактерии в лист(по 1 мл культуры в лист). Для ко-трансформации бактериальные культуры смешивали всоотношении 1:1.
Растения анализировали через 48 – 96 часов после инфильтрации.Локализацию белков в листьях после трансформации анализировали с помощьюконфокального лазерного сканирующего микроскопа (LSM 510 META NLO, CarlZeiss,Германия).2.15. Выделение белков из листьев N. benthamiana, электрофорез белков в ПААГи вестерн-блот гибридизация.Для подтверждения синтеза полноразмерных белков LysM-РПК в листьях N.benthamianaпосле трансформации проводили выделение белков, электрофорез белков вПААГ и вестерн-блот гибридизацию с соответствующими антителами.1-2 трансформированных листа растирали в фарфоровой ступке с жидким азотом,ресуспендировали в буфере (0,1 MMES-KOH, 0,1 мМ PMSF, 1 мМ MgCl2, 1 мМэтилендиаминтетрауксуснаякислота,0,1%сахароза,3%этиленгликоль),центрифугировали 1000 об/мин в течение 20 мин при +4ºC.
Осадок убирали, собраннуюнадосадочную жидкость переносили в чистый эппендорф и центрифугировали при 16000об/мин в течение 45 мин при +4ºC. Жидкость убирали, осадок промывали исходным50буфером, откручивали его 16000 об/мин в течение 45 мин при +4ºC и растворяли в 100 мклисходного буфера, добавляли равный объем буфера для нанесения на гель (200 мМ TrisHCl (pH 6.8), 400 мМβ-меркаптоэтанол, 4% додецилсульфат натрия, 0,01% бромфеноловыйсиний, 40% глицерол).Белковые пробы разделяли в 12 % ПААГ с 0,1% ДСН по методу Laemmli (Laemmli,1970).
Разделение белков проводили в системе для электрофореза Mini-PROTEAN 3компании BioRad (США) при силе тока 15-25 мА на гель в течение 1,5-2 ч.При Вестерн-блот гибридизации белки после разделения в ПААГ переносили нанитроцеллюлознуюмембрану(0,45мкм)спомощьюсистемыMiniTrans-Blot(BioRad,США) по инструкции производителя. Для проверки полноты переноса белковпроводили окрашивание мембран Понсо 4R. Далее проводили гибридизацию с антителами.Для этого мембрану промывали при постоянном перемешивании на шейкере 3DSunflowermini-shaker (Biosan, США) 2 раза по 10 мин в буфере TBS (50 мМ Трис-HCl, pH8.0, 150 мМ NaCl), затем 2 раза по 15 минут буфером T-TBS (50 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 150мМ NaCl, 0,05% Tween-20).
Мембрану инкубировали в растворе, содержащем 1% бычийсывороточный альбумин (БСА) в течение ночи при +4 ºC. После этого проводилиинкубацию с антителами - в 0,5% растворе БСА в течение 2 ч. После этого мембрануотмывали 2 раза по 15 мин буфером T-TBS, 2 раза по 10 мин буфером TBS. Связавшиеся сантителами белки выявляли с помощью хемилюминесцентного метода(BioRad, США). Всеинкубации с антителами проводили при комнатной температуре. Для выявления белковиспользовали следующие антитела: моноклональные анти-FLAGM2 антитела, меченыепероксидазой хрена (horseradishperoxidase, HRP) (Sigma-Aldrich, США) в разведении 1:5000или кроличьи поликлональные анти-RFP антитела (Thermo Scientific, США) в разведении1:2000, с последующей обработкой анти-кроличьими антителами мечеными HRP (SigmaAldrich, США) в разведении 1:5000.
Анти-GFP антитела меченые HRP (Invitrogen, США)также использовались в разведении 1:5000. Молекулярный вес белков определялисравнением с белковым маркером Page Ruler ladder (Thermo Scientific, США).2.16. Трансформация растений с помощью A. rhizogenes.Для изучения роли LysM-РПК К1 гороха была проведена трансформация мутантовRisNod4 и K24 по гену sym37 (близкий гомолог гена К1), а также мутантной линии 817 погену k1. Трансформацию растений гороха осуществляли с помощью штамма A.
rhizogenesArqua1. Штаммы агробактерий, используемые для трансформации, выращивали на твердойсреде TY в течение 2 суток при температуре +28ºC. Семена гороха стерилизовали (см.51раздел 2.4), проростки переносили на свет в коробках, содержащих жидкую среду Jensen иинкубировали в течение двух-трех дней до раскрытия нижних листьев (+21°C, влажности60% и режиме день/ночь 16/8 часов). У проростков главный корень обрезали в областигипокотиля, а на место среза наносили бактерии, содержащие генетическую конструкциюpK7WG2D-K1 или pK7WG2D-Sym37 (положительный контроль) и pK7WG2D-GUS(отрицательный контроль).
Трансформированные проростки помещали в стеклянную банкус твердой средой Jensen, накрывали ватным диском, смоченным в воде, накрывали фольгойиинкубировали в течение 10-12 дней в фитотроне при +21°C, влажности 60% и режимедень/ночь 16/8 часов. После формирования каллуса растения переносили на средуEmergence (cостав (г/л): 2.5 KNO3 , 0,4 MgSO4 × 7H2O , 0,3 NH4H2PO4, 0,2 CaCl2 × 2H2O, 0,01MnSO4 × 4H2O, 0,005 H3BO3, 0,001 ZnSO4 × 7H2O, 0,001 KI, 0,0002 CuSO4 × 5H2O, 0,0001NaMoO4 × 2H2O, 0,0001 CoCl2 × 6H2O, 0,015 FeSO4 × 7H2O, 0,02 Na2EDTA; 1× UM-Cвитамины (Diaz et al., 1989) (мг/л): 100 мио-инозитол , 5 никотиновая кислота , 10пиридоксин-HCl , 10 тиамин-HCl, 2 глицин; 1% сахароза и 3 мМ2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (pH 5.8) для формирования корней, содержащейантибиотик цифотоксин (150 мкг/мл) для подавления развития агробактерий.
Через неделюрастения переносили на среду Emergence без антибиотика на 4-5 дней для развития корней.Образовавшиесякорнипросматривалинафлюоресцентныммикроскопе(StereoDiscoveryV8, CarlZeiss), нетрансгенные корни удаляли. После этого растенияпереносили в горшки с вермикулитом, инокулировали R. Leguminosarum bv.viciaeCIAM1026 (OD600 = 0,1 – 0,2). Растения находились в вентилируемых горшках, укрытыхпленкой, при температуре +22°C и режиме день/ночь 16/8 часов. Анализ формированияклубеньков проводили на 28 дпи.2.17.
Анализ взаимодействия белков с помощью дигибридной дрожжевойсистемы.Для оценки взаимодействия белков использовали дигибридную дрожжевую системуна основе набора Invirogen, США.2.17.1. Приготовление электрокомпетентных клеток дрожжей.Штамм дрожжей S. cerevisiae MaV203 рассевали на чашку с YPD, выращивали двоесуток при 28ºC. В 3 мл жидкой среды YPD вносили одну колонию с чашки, инкубировалиночь на шейкере 220 об/ при 28ºC. В100 мл среды YPD вносили 1 мл ночной культуры и52выращивали при +30 ºC до DO600=1. Затем культуру охлаждали на льду 30 мин, переносилив центрифужные стаканы и откручивали при 3500 об/мин, 5 мин, +4 ºC.
Далее всеманипуляции проводили строго на льду. Среду сливали и ресуспендировали осадок в 100мл стерильной холодной деионизированной воды. Затем центрифугировать при 3500об/мин, 5 мин, +4 ºC. Воду сливали и ресуспендировали осадок в 50 мл стерильнойхолодной деионизированной воды. Снова центрифугировали при 3500 об/мин, 5 мин, +4 ºC.Удаляли воду и ресуспендировали осадок в 20 мл 1M сорбитола. Далее центрифугировалипри 3500 об/мин, 5 мин, +4ºC. Сорбитол удаляли и ресуспендировали осадок в 200 мклхолодного 1M сорбитола. Полученные клетки фасовали по 80 мкл и хранили при -80 ºC.2.17.2. Приготовление селективных сред для анализа.Полная синтетическая среда для дрожжей состоит из источника азота, источникауглерода и раствора, содержащего незаменимые аминокислоты и нуклеиновые кислоты.Для селекционных целей добавляли в среду отдельно приготовленные аминокислоты(лейцин, триптофан, гистидин).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
