Диссертация (Изучение роли рецептор-подобной киназы К1 гороха в контроле формирования симбиотических субклеточных структур), страница 2

Молекулы такойприроды выделяют как патогенные, так и полезные симбиотические микроорганизмы, приэтом хитоолигосахариды и липохитоолигосахариды очень похожи по своей структуре,однако вызываемые ими ответные реакции совершенно противоположны.Индукторами развития симбиоза между бобовыми растениями и бактериямипорядка Rhizobiales являются бактериальные липохитоолигосахариды – Nod-факторы. Этисигнальные молекулы состоят из нескольких остатков N-ацетилглюкозамина (n =3 – 6),соединенныхβ-1,4-гликозиднойсвязью,содержатжирнуюкислотунаневосстанавливающем конце молекулы, а также ряд других заместителей (Spaink, 1991;Denarie, Cullimore, 1993; Geremia et al., 1994; Denarie et al., 1996; Perret et al., 2000).

Врезультате взаимодействия с Nod-факторами у растений активируется комплекс ответныхреакций, которые в конечном итоге приводят к развитию на корнях новых органов —азотфиксирующих клубеньков. Несмотря на то, что Nod-факторы были открыты около 25лет назад, до сих пор представления о молекулярных механизмах рецепции этих молекулпри симбиозе еще далеки от понимания, хотя эта область исследований быстро развиваетсяв последние годы.

Это определяет актуальность и важность поиска рецепторов к этимсигнальным молекулам у различных бобовых растений, а также изучения принципов ихработы.Оказалось, что в узнавание Nod-факторов у растений могут быть вовлеченыпредставители особого класса рецепторов с LysM-мотивами во внеклеточном домене.Впервые у модельного бобового растения лядвенца японского Lotus japonicus,формирующего клубеньки детерминированного типа, были выявлены две рецепторподобные киназы с LysM-мотивами во внеклеточном домене (LysM-РПК) - LjNFR5 иLjNFR1, обе необходимые для инициации развития симбиоза с ризобиями (Madsen et al.,2003; Radutoiu et al., 2003; 2007).Гомологи генов LjNFR5 иLjNFR1 были найдены и у бобовых растений с другимтипом клубенькообразования (формируют клубеньки недетерминированного типа) – улюцерны слабоусеченной Medicago truncatula Gaertn.

(MtNFP и MtLYK3), а также у горохапосевного Pisum sativum L. (PsSym10 и PsSym37). Исследования по влиянию мутантных8штаммов ризобий, выделяющих Nod-факторы с измененной структурой, на развитиеответных реакций у люцерны и гороха показали, что рецепция этих сигнальных молекул уданного типа бобовых растений может быть организована более сложным образом, чем уL. japonicus.

Была предложена гипотеза, согласно которой в распознавание Nod-факторов уэтих растений могут быть вовлечены два типа рецепторов, контролирующих разные этапыразвития симбиоза. Один из рецепторов – «сигнальный» (от англ. signaling receptor)контролирует развитие самых ранних симбиотических реакций, а другой - рецептор«проникновения» (от англ.

entry receptor) вовлечен в регуляцию более поздних стадийсимбиоза,связанныхсразвитиеминфекциииорганогенезомклубенька.Этопредположение согласуется с анализом мутантов люцерны и гороха по генам, кодирующимLysM-РПК. Фенотипический анализ мутантов показал, что MtNFP и PsSym10 могут бытьнеобходимы для инициации симбиоза, тогда как MtLYK3 и PsSym37 контролируют болеепоздние стадии развития симбиоза, связанные с инфекционным процессом.Однако данные о том, что MtNFP и PsSym10 обладают неактивными киназнымидоменами (не способны к авто- и трансфосфорилированию) (Madsen et al., 2003), а такжепредставление о том, что для активации трансмембранных рецепторов необходима ихолигомеризация, указывают на возможность участия в контроле развития симбиозадополнительныхрецепторов,которыеостаютсянеизвестными.Этоопределяетнеобходимость поиска дополнительных рецепторных киназ, участвующих в передачесигнала от Nod-фактора, и дальнейшего изучения организации рецепторов и механизмов ихактивации.Ранее выполненные исследования на горохе позволили выявить нескольковозможных кандидатов на роль таких рецепторов.

Сравнительный анализ развитиясимбиоза у европейских и афганских сортов гороха позволил выявить ген Sym2,определяющий штаммо-специфичный характер инокуляции (Разумовская, 1931; Goetz etal., 1985). Необходимость выделения штаммами, заражающими афганские сорта гороха,Nod-факторов с ацетилом на невосстанавливающем конце молекулы, предполагаетвозможную функцию Sym2 в качестве рецептора к этим молекулам. Долгое времяпоследовательность гена, кодирующего ген Sym2, оставалась неизвестной, лишь недавноудалось выявить предполагаемый кандидат на роль Sym2 – ген PsLykX (Sulima et al., 2017)Более того, при скрининге библиотеки кДНК инокулированных корней гороха спомощью LjNFR1 помимо Sym37 был выявлен также имеющий с ним высокий уровеньсходства ген K1, кодирующий LysM-РПК с полноценной киназой.Это определилозначительный интерес к выяснению роли этого рецептора в развитии симбиоза.

Такимобразом, наличие у гороха нескольких LysM-рецептор-подобных киназ делает его удобной9модельюдляизучениярецепцииNod-факторовубобовыхрастенийснедетерминированным типом клубенькообразования.Цель и задачи работыОсновной целью диссертационной работы являлось изучение роли LysM-РПК К1 у горохаP. sativum L. при развитии симбиоза с клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarumbv. viciae.В работе были поставлены следующие задачи:1.Анализ уровня экспрессии гена К1 при развитии клубеньков с помощью методаколичественной ОТ-ПЦР.2.Выявление с помощью TILLING подхода мутантов по гену k1 и их генотипическаяи фенотипическая характеристика.3.Комплементация мутантных генов k1 и sym37 c помощью полноразмерныхпоследовательностей этих генов гороха дикого типа для проверки функциональнойвзаимозаменяемости.4.Анализ способности рецептор-подобной киназы К1 формировать олигомерныекомплексы с другими известными рецепторными киназами гороха Sym10 и Sym37 вразличных гетерологичных системах (модифицированный FRET-анализ и дрожжеваядвугибридная система).5.Построение схемы работы рецепторов к Nod-факторам у гороха.Научная новизна.

В ходе выполнения данной работы была впервые изучена роль новойLysM-РПК К1 гороха в контроле развития симбиоза с клубеньковыми бактериями. Впервыебыли найдены с помощью TILLING подхода и фенотипически описаны мутанты по гену k1.Наличие двух мутантов с Nod-фенотипом и данные по комплементации позволили сделатьвывод о том, что LysM-РПК К1 необходима для контроля развития симбиоза у гороха. Приэтом впервые у бобовых с недетерминированным типом клубеньков охарактеризованрецептор с активным киназным доменом, который в составе гетеролигомерного комплексаучаствует в инициации развития симбиоза.

Впервые предложена модель работы несколькихолигомерных рецепторных комплексов, участвующих в узнавании Nod-факторов у гороха.10Глава I. Обзор литературы.Часть 1. Необходимость рецепторов для регуляции жизнедеятельности растений.Успешные жизнь и развитие живого организма зависят от его способностивоспринимать и адекватно реагировать на внешние (первичные) сигналы. Такимисигналами могут быть факторы окружающей среды (температура, свет, влажность,давление и др.), а также различные химические соединения (субстраты, пептиды, гормоны).В связи с этим изучение молекулярных механизмов восприятия клетками внешнихсигналовиформированияклеточногоответаявляетсяоднойизосновныхфундаментальных проблем биологии.У животных и человека исследование этой проблемы непосредственно связано сразработкой подходов для лечения заболеваний, связанных с изменением способностиклетки воспринимать внешние сигналы - диабет, сердечные заболевания, рак, болезньАльцгеймера (Pires-daSilva et al., 2003).У растений исследование способности узнавать внешние сигналы и специфичнымобразом на них реагировать направлено на изучение механизмов адаптации кизменяющимся условиям окружающей среды, что является залогом их успешногосуществования.В общем виде последовательность событий при узнавании клетками внешнегосигнала сводится к активации рецептора, что вызывает изменение его пространственнойконформации.Такойрецепторстановитсяспособнымлибонепосредственновзаимодействовать с другими регуляторами сигнального пути, либо влияет на появлениевторичных сигналов (ионов кальция, циклических аденозинмонофосфата (цАМФ) игуанозинмонофосфата (цГМФ), инозитолтрифосфата (IP3) и диацилглицерола (ДАГ)), чтоприводит в конечном итоге к активации внутриклеточных мишеней.Таким образом, распознавание внешнего сигнала происходит благодаря работеспециальных рецепторов (белков или гликопротеинов), расположенных в клеточной стенкеили в плазматической мембране клетки, а также в мембранах клеточных органелл или вцитоплазме.

Это определяет значительный интерес к поиску рецепторов и изучениюмеханизмов их активации.Растения ведут неподвижный образ жизни и поэтому, возможность их успешногосуществования зависит от того, насколько быстро и эффективно они способны реагироватьна поступающие внешние сигналы. Из-за большого разнообразия сигналов, на которыерастению необходимо отвечать, количество рецепторов у растений значительно превышает11их число у животных (Haffaniet al., 2004).