Диссертация (Репаративные и предраковые процессы при ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки), страница 7

В 148 случаях с выявленной патологией шейкиматки помимо цитологического анализа проводили молекулярно-биологическоеисследование с целью изучения экспрессии маркеров p16/Ki67 в цитологическихпрепаратах, приготовленных из остаточного материала виал. Кроме того,проводиласькольпоскопияподозрительныхучастковсприцельнымцервикальноговзятиемканаладляизмененныхилигистологическогоисследования, в случаях диагностирования ЦИН≥II проводили конизацию шейкиматки. Все пациентки были разделены на 3 группы в зависимости отморфологического типа патологического процесса шейки матки: хроническийцервицит (42 женщин), ЦИН<II (39 женщин), ЦИН≥II (67 женщин).На третьем этапе было проведено иммуногистохимическое исследованиебиосийного материала, полученного от 61 впч-инфицированной женщинырепродуктивного возраста, выделены 4 группы: хронический цервицит (15женщин), ЦИН<II (12 женщин), ЦИН≥II (25 женщин), микро-инвазивный ракшейки матки (9).

Возраст обследованных женщин составлял от 17 до 56 лет(средний возраст 36.5 лет).472.2. Методы исследованияГистологический и иммуногистохимический методыБиопсийный материал был представлен соскобами цервикального канала,биоптатами шейки матки в случаях хронического цервицита и ЦИН<II, а такжеоперационным материалом (резецированные конусы шейки матки) при ЦИН≥II имикро-инвазивном раке. Ткань фиксировали в 10% нейтральном забуференном(рН 7,4) формалине в течение 24 часов, заливали в парафин и готовили серийныепарафиновые срезы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали гематоксилином иэозином и инкубировали в ретривере для восстановления антигенности тканей.Ставили иммуногистохимические реакции с использованием моноклональныхантител к C-Myc (clone Y69, Abcam), P53 (RTU, клон DO-7 RTU, N158187-2,DAKO), HIF1-alpha (клон 241812, R&D Systems), VEGF (clone EP1176Y, ab52917,Abcam), Oct-4 (MRQ-10, 309M-15,CELL MARQUE CORPORATION), Aldh1A1(clone EP1933Y, cat.

GTX61645, GeneTex), CD34 (Class II, clone QBEnd 10, DAKO),NF-kB (p65 antibody, clone E379, Abcam) и двойной окраски P16/Ki67 (CINtecPLUS cytology kit, Рош). Докрашивание ядер осуществлялось гематоксилином.Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидазного метода свысокотемпературной или ферментной демаскировкой антигенов. Для проверкиполученных результатов применяли позитивные контроли антигенов, негативныеконтроли антигенов и негативные контроли антител [2]. Результаты оценивали попроценту окрашенных эпителиальных клеток СЭМС и прилежащего плоскогоэпителия в процентном соотношении из расчета на 300 клеток. Низкой экспрессий48маркера считалась окраска ≤ 20%, умеренной - ＞20%, ≤ 40%, высокой - ＞40%. Гистологическим методом определяли ЦИН (ЦИН ＜II – по последнейгистологической классификации WHO (2014) соответствует L-SIL, ЦИН≥II –H-SIL) и микроинвазивный рак шейки матки.Для анализа морфологических показателей производили микрофотосъемкуцифровой камерой «Olympus» (Япония, 12.0 мегапикселей) на базе микроскопа«Olympus»(Олимпус, Япония) , «ZEISS», «Axiostar plus» (Карл Цейс, Германия) сиспользованием объектива х40, х60 и окуляра х10.Жидкостная цитологияПри цитологическом исследовании материал собирался щетками SurePath ввиалы (BD, США), с помощью TriPath процессора (BD, США) приготавливалисьи окрашивались по Папаниколау цитологические препараты.

Мазки былиисследованы и классифицированы по системе Terminology Bethesda System 2001(TBS).Иммуноцитохимия с p16/ki67 двойной окраскойИспользовали набор (CINtec PLUS, mtm laboratories, Германия), специальноразработанный для одновременного качественного определения p16 и Ki67 вцитологических препаратах, приготовленных из остаточного материала. Длявизуализации мест связывания антител с антигенами использовали реакциюокисления субстрата 3,3-диаминобензидина пероксидазой хрена в присутствииперекиси водорода с образованием водонерастворимого конечного продуктакоричневого цвета (р16) и реакцию взаимодействия щелочной фосфатазы с49хромогеном Fast Red c образованием водонерастворимого осадка красного цвета(Ki67).

Все иммуноокрашенные слайды были проанализированы независимотремя цитопатологоанатомами. Выявление двойной окраски даже в однойатипичной эпителиальной клетке рассматривали как положительный ответиммуноокрашивания. Отсутствие экспрессии либо р16, либо Ki67 оценивали какотрицательный признак опухолевой трансформации клеток плоского эпителия.Молекулярное исследование (ВПЧ-тестирование методом ПЦР-НВ)Цитологический и биопсийный материал использовали для генотипированияДНК и выявления ВПЧ методом ПЦР-НВ, которые проводили на приборе Cobas4800,представляющемсобойполностьюавтоматизированнуюсистему,выдающую результат по трем отдельным каналам: индивидуально ДНК ВПЧ16,ДНК ВПЧ18 и общий пул ДНК других 12 высокоонкогенных генотипов ВПЧ (31,33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68) [32].

Главными преимуществами данноготипа ВПЧ-тестирования являются обнаружение высокой вирусной нагрузки,имеющей клиническое значение и генотипирование, позволяющие выявлятьгруппы женщин с высоким онкогенным риском, имеющих ДНК ВПЧ 16 и 18типов.Статистические методыСтатистическая обработка накопленных данных, их группировка, построениеграфиков и диаграмм проводилась при помощи пакета статистических программIBM SPSS Statistics 23.0 и Microsoft Excel 2010. Данные представляли в виде M±m, где M – среднее арифметическое, m – статистическая погрешность среднего.50Также рассчитывали среднеквадратичное отклонениеσ и коэффициентыасимметрии и эксцесса.

Величины коэффициентов асимметрии и эксцесса былиневелики, однако из-за небольшого размера сравниваемых групп использованиеметодов параметрической статистики все равно могло быть некорректным, в связис этим мы использовали также и аналогичные непараметрические методы.Морфометрическое исследование проведено с помощью программы CellSensStandard. Для поиска связей между показателями использовали коэффициенткорреляции Пирсона и коэффициент ранговой корреляции Спирмена, длясравнения показателей в группах использовали непараметрический критерийМанн-Уитни. Различия считали статистически достоверными (статистическизначимыми) при р.<0,05.Для оценки эффективности методов использовался ROC(receiver operatingcharacteristic)-анализа [48].

ROC-кривая представляет собой график, позволяющийоценить качество выбранного метода, отображающий соотношение между долейверных положительных значений от общего числа положительных значений(истинно положительное значение, называемое чувствительностью метода), сдолей ошибочных положительных значений от общего числа отрицательныхзначений (ложно-положительный результат), величина (1-ЛПР называетсяспецифичностью метода). Количественную интерпретацию ROC даѐт показательAUC (area under ROC curve, площадь под ROC-кривой) — площадь, ограниченнаяROC-кривой и осью доли ложных положительных значений.

Чем выше51показатель AUC, тем качественнее метод, при этом значение 0,5 демонстрируетнепригодность выбранного метода.Так же проводили морфометрию с помощью программы cellSens Standard.Измеряли глубину инвазии (Рис.1) при микроинвазивной карциноме и площадиСЭМС. Программа cellSens Standard включает в себя комплексный подход,позволяющий плавно и быстро перейти от исходного изображения к анализу изаключению всего за несколько простых шагов. Даже такие продвинутыефункции, как деконволюция несмешиваемость и представление данных являютсябыстрыми и интуитивными.Рисунок 1 Морфометрия глубины инвазии при MSCC с помощью программыcellSens Standard.52ГЛАВА 3.

Результаты и их обсуждение3.1. Ранняя диагностика ВПЧ-ассоциированных рака и предрака шейкиматки у женщин до 30 лет и старшеЖидкостное цитологическое исследованиеВходецитологическогоинтраэпителиальногопораженияисследованиявысокойдиагнозстепениплоскоклеточного(H-SIL)ставилсяприобнаружении крупных комплексов разрозненно лежащих атипичных клетокплоского эпителия полиморфного вида с резко выраженным дискариозом, а такжефигурами митозов (рис.2). При L-SIL выявляются клетки плоского эпителия слегким дискариозом в сочетании с наличием сохранных зрелых клетокпарабазального и поверхностного слоев (рис.3). Диагноз ASC-US ставился приналичии в мазках отдельных групп клеток плоского эпителия с укрупненными игиперхромными ядрами на фоне воспаления (рис.4). В ASC-US-H определиликомплексы и отдельно лежащие атипичные клетки плоского эпителия сукрупненными и гиперхромными ядрами, подозрительными в отношении H-SIL.В мазках, негативных в отношении интраэпителиального поражения, содержалисьединичные койлоциты, лейкоциты, пласты плоского и цилиндрического эпителияс реактивными изменениями и явлениями лейкопедеза, атипичные клеткиотсутствовали, что соответствует диагнозу NILM (рис.5).При проведении цитологического исследования мазков из цервикальногоканала были обнаружены следующие изменения: H-SIL у 21 женщины (5 женщиндо 30 лет и 16 после 30 лет), L-SIL у 23 женщин (10 и 13 соответственно), ASC-US53у 15 женщин (7 и 8 соответственно) и NILM у 32 женщин (13 и 19соответственно).Рисунок 2.

H-SIL, жидкостной цитологический мазок, окраска по Папаниколау,×400Рисунок 3 L-SIL, жидкостной цитологический мазок, окраска по Папаниколау,×40054Рисунок 4 ASCUS-R, жидкостной цитологический мазок, окраска по Папаниколау,×400Рисунок 5 NILM, жидкостной цитологический мазок, окраска по Папаниколау,×40055Выявление ДНК ВПЧ с помощью Сobas 4800 теста и сравнение полученныхрезультатов с гистологическим заключением.Далее проводилось выявление ДНК ВПЧ в цитологическом материалеметодом ПЦР-НВ с помощью Сobas 4800 теста и сравнение полученныхрезультатов с гистологическим заключением.

Результаты ВПЧ тестированияприведены в таблице 1.Таблица 1Выявление ДНК ВПЧ у обследуемых женщин до 30 лет и старше.≤ 30 лет>30 летHPV-HPV+HPV-HPV+NILM49136ASC-UC3426L-SIL28211H-SIL14115В результате проведенных исследований ДНК ВПЧ (таблице 1) обнаружили у63 женщин из 91 (69,2%), из которых 35 женщин моложе 30 лет и 38 старше 30 лет.При этом наличие ВПЧ при отсутствии атипичных клеток обнаруживалось в 2 разачаще у женщин моложе 30 лет (69.2%) по сравнению с женщинами старше 30 лет(32.1%).

Полученные результаты подтверждают данные других исследователей[63].56В материале с диагнозом NILM выявили ДНК ВПЧ в 15 образцах из 32(46,9%). При этом в 9 образцах из 13 (69,2%) в группе пациенток ≤ 30 лет и в 6 из19 (31,6%) в группе пациенток >30 лет. В образцах с ASC-US положительныйрезультат получили в 10 из 15 случаев: в 4 образцах из 7 в группе пациенток ≤ 30лет и в 6 из 8 в группе пациенток >30 лет. По сравнению с NILM (46,9%) в мазкахс ASC-US ДНК ВПЧ выявляется чаще (66,7%), что согласуется с вкладом данногоинфекционного агента в развитие ЦИН.