Диссертация (Репаративные и предраковые процессы при ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки), страница 9

Обследовали цитологический и биопсийныйматериал 148 женщин с патологией шейки матки.Проводили цитологическое исследование мазков из цервикального канала,приготовленныхметодомжидкостнойцитологии.Взависимостиотцитологического диагноза всех пациенток разделили на пять групп: H-SIL (57женщин), L-SIL (39), ASC-US-H (4), ASC-US-R (26) и NILM (22).Иммуноцитологическое и иммуногистологическое исследование методомдвойной окраски р16/Ki67Далее проводили двойное иммуноокрашивание цитологических препаратов сиспользованием двух антител р16 и Ki67.

Экспрессию р16/Ki67 выявляли как вотдельно лежащих атипичных клетках, так и в комплексах атипичных клетокплоского эпителия. Количество положительных клеток с двойной окраской непревышало 30 % от общего числа клеток при L-SIL (рис.11) и составило от 30 %до 100% в H-SIL (рис.12). В NILM выявляли отдельные р16-положительные67клетки, а также атрофические и дистрофические изменения, что позволилоотнести их в категорию «стареющих» клеток [96]. Диагноз ASC-US-R иASC-US-H по результатам проведения двойного иммуноокрашивания былиизменены на H-SIL (7 женщин), на L-SIL (4), либо на NILM (19). Кроме того, втрех случаях L-SIL изменили на H-SIL, так как количество атипичных клеток сдвойным окрашиванием составляло до 90% всех клеток комплекса.

В одномслучае цитологический диагноз L-SIL изменили на NILM из-за отсутствияэкспрессии онкомаркеров р16 и Ki67 в клетках плоского эпителия шейки матки.Гистологический ответ «хронический цервицит» подтвердил правильностьизменения диагноза. Метод двойного иммуноокрашивания не требует подсчетапозитивных клеток, согласно инструкции производителя. Тем не менее, мыувидели прямую взаимосвязь числа р16/Ki-67–положительных клеток состепенью поражения шейки матки. Так, в цитологических препаратах с диагнозомH-SIL содержание позитивных клеток с двойной окраской в комплексахатипичных клеток плоского эпителия шейки матки cоставляло 80-100 %.

Нашинаблюдения совпали с результатами Yoshida T [138].ИГХ исследование образцов с ЦИН≥II показало повышенную экспрессиюбелка р16 по всей глубине эпителиального слоя, а Ki67 - от 60% до 100 %эпителиальных клеток шейки матки (рис.13).68Рисунок 11 L-SIL, количество положительных клеток с двойной окраской непревышает 30 % от общего числа клеток. ИЦХ с использованием двух антителр16 и Ki67, ×400Рисунок 12 H-SIL, количество позитивных клеток с двойной окраской в комплексах атипичныхклеток плоского эпителия шейки матки составляет 80-100 %.

ИЦХ с использованием двухантител р16 и Ki67, ×40069Рисунок 13 ЦИН≥II, ИГХ с использованием двух антител р16 и Ki67, ×200ВПЧ-тестирование методом ПЦР-НВ на приборе Cobas 4800Выявление ДНК ВПЧ в цитологическом материале проводили методомПЦР-НВ на приборе Cobas 4800 и сравнивали полученные результаты сгистологическим заключением. В мазках с диагнозом NILM обнаружили ДНКВПЧ в 1 образце из 22 (4,55%) (Диаграмма.5).

В образцах с диагнозом L-SIL тестбыл положительным в 34 случаях из 39 (87,18 %). Наиболее часто наблюдалисочетание общего пула 12 типов высокоонкогенного типа ВПЧ (31, 33, 35, 39, 45,51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68) и ДНК ВПЧ 16 типа - в 23 из 34 мазков (67,65%)(Диаграмма.6).В образцах с диагнозом L-SIL были обнаружены ДНК ВПЧ в 34случаях из 39 (87,18 %). В материале с H-SIL выявлялся ДНК ВПЧ в 53 образцахиз 57 (92,98%), причем преимущественно ДНК ВПЧ 16 типа (в 40 случаях из 53 75,47%) (Диаграмма.7). В образцах с диагнозом ASC-US-R - в 8 случаях из 26(30,77 %), ASC-US-H - в 2 из 4 (50,0%).Причем, чаще всего в 8 из 11 (72,72%)70образцов выявляли общий пул 12 типов высокого онкогенного типа ВПЧ(Диаграмма.8).Диаграмма 5 Результаты ВПЧ-тестирования в мазках с диагнозом NILM, (кол-во больных, %)..Диаграмма 6 Результаты ВПЧ-тестирования в мазках с диагнозом L-SIL.

(кол-во больных, %).ВПЧ-, 4,7%H-SILВПЧ+, 13,23%ВПЧ+16ВПЧ+ВПЧВПЧ+16,40, 70%Диаграмма 7 Результаты ВПЧ-тестирования в мазках с диагнозом H-SIL. (кол-во больных, %).71Диаграмма 8 Результаты ВПЧ-тестирования в мазках с диагнозом ASC-US. (кол-вобольных, %).Гистологическое исследование.Во всех 148 отобранных случаях было проведено гистологическоеисследование биопсийного и хирургического материала.

Гистологическоезаключение является «золотым стандартом» в диагностике ЦИН. Хроническийцервицит выявили в 42 образцах из 148 (28,38%). Он характеризовалсялимфомакрофагальной инфильтрациейстромыткани, частос примесьюплазматических клеток. В эпителии встречали признаки акантоза, гиперкератоза,клеточного полиморфизма (рис.14). В 39 образцах (26,35%) обнаружилипатологию шейки матки ЦИН<II со слабо выраженными изменениями строенияэпителия при умеренной пролиферации базальных клеток. Морфологическиепризнаки папилломавирусной инфекции: паракератоз, койлоцитоз, явлениядискариоза и фигуры митозов (рис.15).

В 67 случаях (45,27%) был выявленЦИН≥II с выраженными морфологическими изменениями шейки матки, которыеохватывали свыше двух третей эпителия и характеризовались появлением72патологических митозов, наличием многократно увеличенных гиперхромных ядерклеток (рис.16).Рисунок 14 Хронический цервицит на фоне ВПЧ-инфекции. Гистологическое исследование.Окраска гематоксилином и эозином. ×100Рисунок 15 Патология шейки матки ЦИН<II на фоне ВПЧ-инфекции.Гистологическое исследование. Окраска гематоксилином и эозином. ×10073Рисунок 16 Патология шейки матки ЦИН≥II на фоне ВПЧ-инфекции.Гистологическое исследование.

Окраска гематоксилином и эозином. ×200Определение чувствительности и специфичности методов жидкостнойцитологии, двойного окрашивания р16/Ki67 и ВПЧ-тестирования.Проводилиоценкучувствительностииспецифичностиметодовжидкостной цитологии, двойного окрашивания р16/Ki67 и ВПЧ-тестирования.При этом, гистологическое и ИГХ заключения служили критерием достоверностидиагноза. В литературе описаны случаи расхождения гистологических ответовбиопсийного материала и последующей конизации шейки матки [45]. Приинтерпретации двойного иммуноокрашивания возможны ложноположительныерезультаты, так как отдельные клетки плоскоклеточной метаплазии, трубнойметаплазии и эндоцервикальные клетки могут экспрессировать р16 и Ki67, атакже антитела могут дать неспецифическое связывание с остатками слизи изцервикального канала. Последнюю проблему решает жидкостная цитология, так74как транспортная среда содержит мягкий компонент, лизирующий слизь.Ложно-негативные результаты возможны при условии повреждения цитоплазмыклеток, а также в случаях, когда повышенная экспрессия р16 (коричневая окраска)в ядре клеток перекрывает красную окраску ядра (Ki67).Результаты наших расчетов чувствительности и специфичности различныхметодов диагностики представлены в таблице 3.Чувствительность цитологического метода исследования при выявлениихронического цервицита составила 80,0%, при патологии шейки матки ЦИН < II72,14%, при ЦИН ≥ II – 95, 31%.

Чувствительность ВПЧ-тестированияпроведенного с использованием Сobas 4800 теста, составила в случаяххронического цервицита 88, 89%, при патологии шейки матки ЦИН < II – 97,14%,а при ЦИН ≥ II – 95,45%.Также определяли чувствительность двойного окрашивания р16/Ki67,которая при хроническом цервиците, составила 92,68%, при патологии шейкиматки ЦИН < II – 94,73% и при ЦИН ≥ II – 98,48%. Наиболее чувствительнымметодомвыявленияхроническогоцервицитаявляетсяИЦХ,таккакморфологические изменения имеют не столь очевидный характер при данномзаболевании, а ВПЧ-тестирование дает информацию только о наличии вируснойДНК. И лишь двойное окрашивание позволяет правильно оценить реакциюорганизма на присутствие инфекции и воспалительных процессов.НаибольшуючувствительностьприЦИН<IIобнаружилиприВПЧ-тестировании, а для ЦИН ≥ II – при использовании ИЦХ.

Сobas 4800 тест75уступал ИЦХ по чувствительности в силу того, что система выявляет только 14высокоонкогенных типов ВПЧ, но были выявлены случаи ЦИН ≥ II, в которыхвирусная ДНК не была обнаружена. По-видимому, исследуемые образцысодержали другие типы ВПЧ.Специфичность цитологического метода составила 90,90% при выявлениихронического цервицита и была абсолютной 100,0% при обнаружении ЦИН < II иЦИН ≥ II. Специфичность Сobas 4800 теста при выявлении хроническогоцервицита была 41,67%, при ЦИН < II 50,0% и 100,0 % при обнаружении ЦИН ≥II. Специфичность ИЦХ р16/Ki67 составила 100,0% при всех рассматриваемыхвидах патологии шейки матки в данной работе.Таблица 3Чувствительность и специфичность метода двойного окрашиванияпри выявлении патологии шейки матки.ГистологическийдиагнозХроническийцервицитчувствительность, %Цитологи-ческийИЦХдиагноз80,0092,68специфичность, %Cobasтест88,89Цитологиче-скийИЦХдиагноз90,90100,00Cobasтест41,67ЦИН < II72,1494,7397,14100,00100,0050,00ЦИН ≥ II95,3198,4895,45100,00100,00100,00Резюмируя,полученныеданныеустановлено,чтонаибольшаяэффективность диагностики ВПЧ-ассоциированной патологии шейки маткипринадлежит комплексу методов: жидкостной цитологии, двойного окрашиванияp16/Ki67 и ВПЧ-тестирования методом ПЦР-НВ.763.3.