Диссертация (Репаративные и предраковые процессы при ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки), страница 10

Изучение репаративных, неопластических и раковых сфероидныхструктур при ВПЧ-ассоциированном предраке и раке шейки матки:морфологические и иммунофенотипические особенности.ГистологическоеисследованиевыявлениеСЭМСметодомИГХсиспользованием антител к Oct-4 и морфометрия СЭМСНа третьем этапе были изучены морфологические и иммунофенотипическиеособенности СЭМС при ВПЧ-ассоциированном плоскоклеточном предраке и ракешейки матки. Проводили гистологическое исследование материала от 61пациенткисцитологическойиПЦР-диагностикойВПЧ-ассоциированнойпатологии шейки матки: хроническим цервицитом (15 женщин), ЦИН<II (12женщин), ЦИН≥II (25 женщин) и микроинвазивной плоскоклеточной карциномешейки матки (9женщин).Молекулярное исследование (ВПЧ-тестирование)ВПЧ-тестирование цервикального содержимого, полученного при заборецитологического материала от данных пациенток, проводили на приборе Cobas4800 методом ПЦР-НВ.

Все образцы дали положительные результаты. ДНК ВПЧ16 типа была обнаружена в 19 случаях (31,15%), ДНК ВПЧ 18 типа - в 4 случаях(6,55%), а ДНК ВПЧ других 12 высокоонкогенных типов - в 38 случаях (62,30%).В результате гистологического исследования биоптатов шейки маткиморфологический диагноз хронического ВПЧ-ассоциированного цервицитаустанавливался на основании обнаружения лимфогистиоцитарной инфильтрации77подслизистого слоя, лейкопедеза в эпителиальном пласте, наличии акантоза,очаговой плоскоклеточной метаплазии и койлоцитоза.При ЦИН<II и ЦИН≥II обнаруживались признаки хронического воспаления икойлоцитоза,атакжепоявлениеатипичныхклетоксукрупненнымигиперхромными ядрами, которые в случае ЦИН<II занимали до 1/3 толщиныплоского эпителия, а в случае ЦИН≥II – более 2/3.

Отличительной чертой MSCCбыло обнаружение клеток с более выраженными признаками атипии, в том числекрупнымиядрами,занимающимиболееполовиныдиаметраклеток,ипатологическими фигурами митоза, а также разрушение базальной мембраны смикроинвазией раковых клеток в подслизистый слой на глубину не более 5 мм.(рис.17)Рисунок 17 Микроинвазивный рак шейки матки. Гистологическое исследование. Окраскагематоксилином и эозином. ×20078Ранее было обнаружено формирование СЭМС в плоском эпителии приВПЧ-ассоциированном хроническом цервицитеиЦИН,экспрессируют маркер эмбриональных стволовых клетокклеткикоторыхOct-4. СЭМС, клеткикоторых не имели признаков клеточного атипизма, не экспрессировали р16 исодержалиKi67, были названы нами репаративными СЭМС, в то время какдругие СЭМС, построенные из атипичных клеток, экспрессирующие и Ki67 и p16,получили название опухолевых СЭМС.В ходе нашего гистологического и ИГХ исследований были выявлены разныевидыСЭМС.СЭМСбылиидентифицированыприиспользованиииммуногистохимической реакции с моноклональными антителами к Oct-4,экспрессия этого маркера наблюдалась во всех клетках сфероидов.

Oct-4выявлялся в виде коричневого окрашивания ядер и цитоплазмы клеток, которыерасполагались по всему периметру СЭМС, а также в отдельных прилежащих кСЭМС эндотелиоцитах и клетках соединительной ткани (рис.18).Согласно результатам исследования, Oct-4 также экспрессировали в клеткахэпителия окружающие сфероиды в 2%, 7%, 10% и 7% клетках при хроническомцервиците, ЦИН<II, ЦИН≥II и MSCC соответственно (Диаграмма.9).

В целом,Oct-4 определялся в эпителии шейки матки при хроническом цервиците в среднемв 13.5% клеток, при ЦИН<II - в 33.5% клеток, при ЦИН≥II в 43.75% клеток и примикроинвазивной карциноме - в 48.5% (Диаграмма.10).79Рисунок 18 Экспрессия Oct-4 в СЭМС. ИГХ с использованием антител к Oct-4 ,×600OCT4 в окружающем сфероидыэпителии100.00%90.00%80.00%70.00%60.00%50.00%40.00%30.00%20.00%10.00%0.00%2.00%ChCer7.00%ЦИН<II10.00%ЦИН≥II7.00%MSCCДиаграмма 9 Экспрессия Oct-4 в окружающем сфероиды эпителии при ВПЧ-ассоциированнойпатологии шейки матки.80OCT4 в слизистой шейки матки100.00%90.00%80.00%70.00%60.00%50.00%40.00%30.00%20.00%10.00%0.00%43.75%48.50%33.50%13.50%ChCerЦИН<IIЦИН≥IIMSCCДиаграмма 10 Экспрессия Oct-4 в слизистой шейки матки при ВПЧ-ассоциированнойпатологии шейки матки.По структурными особенностями и экспрессии биомаркѐров СЭМС былиразделены на три вида: репартивный (СЭМС 1 вид), неопластический (СЭМС 2вид), раковый (СЭМС 3 вид).

При хроническом цервиците обнаруживалисьСЭМС 1 вида, при ЦИН<II – преобладали СЭМС 1 вида в сочетании с СЭМС 2вида, при ЦИН≥II – СЭМС 2 вида, а при микроинвазивной карциноме – СЭМС 3вида (в окружающей ткани с морфологией ЦИН<II и ЦИН≥II обнаруживалисьтакже СЭМС 2 вида).В ходе гистологического исследования было выявлено: 1вид – репаративныйСЭМС формировались вблизи и на территории акантотических тяжей вокругсосудов, имели небольшие размеры и состояли из крупных эпителиальных клетоктипа базальных (рис.19); 2 вид – неопластический СЭМС имели большие размерыпо сравнению с репаративными, в центре не всегда определялись сосуды, всоставе гнопластических СЭМС имелись эпителиальные клетки с признаками81атипизма. (рис.20); 3 вид – раковый СЭМС крупные размеры, часто сливалисьмежду собой и были образованы атипичными раковыми клетками.

(рис.21,22).Рисунок 19 Репаративный СЭМС. Гистологическое исследование, окраска г/ э, ×400Рисунок 20 Неопластический СЭМС. Гистологическое исследование, окраска гематоксилиноми эозином, ×40082Рисунок 21 Раковый СЭМС. Гистологическое исследование, окраска гематоксилином и эозином,×400Рисунок 22 Раковый СЭМС. Гистологическое исследование, окраска гематоксилином и эозином,×400Также проводили морфометрическое исследование, измеряли площадиразных видов СЭМС с использованием программы cellSens Standard (таб.4).83Приморфометрическомисследованиинаименьшийразмеримелирепаративные СЭМС, их средняя площадь составила 1141.1±305.0 mkm2 (рис.23);неопластические СЭМС имели большие размеры по сравнению с репаративными(Р.<0/001), их средняя площадь составила 2553.9±656.2 mkm2 (рис.24); раковыеСЭМС обладали наибольшими размерами по сравнению с репаративными инеопластическими СЭМС - 7308.7±3031.3 mkm2 (Р<0,001) (рис.25,26) и нередкосливались друг с другом.Таблица 4Площади разных видов СЭМС.

Различия достоверны - Р<0.001.Площадь репаративныхПлощадь неопластическихПлощадь раковых СЭМССЭМС (mkm2)СЭМС (mkm2)(mkm2)1181.001890.0010549.521569.981238.299459.931358.243057.105071.32764.443110.442583.781509.222437.5612400.021120.332890.008763.341430.211861.473681.04864.003479.037890.25988.372784.234607.56655.212790.598080.09Средняя площадь –1141.1±305.0Средняя площадь – 2553.9±656.2Средняя площадь –7308.7±3031.384Рисунок 23 Морфометрия репаративного СЭМС с помощью программы cellSens Standard.ИГХ с использованием антител к Oct-4, ×400Рисунок24 Морфометрия неопластического СЭМС с помощью программы cellSens Standard.ИГХ с использованием антител к Oct-4, ×40085Рисунок 25 Морфометрия ракового СЭМС с помощью программы cellSens Standard.

ИГХ сиспользованием антител к Oct-4, ×400Рисунок 26 Морфометрия неопластического СЭМС с помощью программы cellSens Standard.ИГХ с использованием антител к Oct-4, ×40086Иммуногистохимическое исследованиеДалее проводили иммуногистохимические исследования материала с разнойпатологиейшейкиматкисиспользованиемразличныхантителдлядифференцировки СЭМС разных видов при ВПЧ-ассоциированной патологиишейки матки по экспрессии онкомаркеров р16 (CINtec PLUS cytology kit, Рош),C-MYC(clone Y69, Abcam) и р53 (RTU, клон DO-7 RTU, N158187-2, DAKO), атакже маркеров гипоксии и ангиогенеза HIF-1(клон 241812, R&D Systems) иVEGF (clone EP1176Y, ab52917, Abcam).Изучение экспрессии p16 и Ki67 методом двойной окраски p16/ Ki67При двойной окраске p16/ Ki67, СЭМС 1 вида содержали клетки,экспрессирующие только Ki67 в 20% эпителиальных клеток, что наблюдалось прихроническом цервиците.

В СЭМС 2 вида и 3 вида, клетки экспрессировалиодновременно оба маркера. При этом одновременная экспрессия p16/ Ki67определялась в 7,5% эпителиальных клеток сфероидов при ЦИН<II, и в 55 % приЦИН≥II, а при микроинвазивной карциноме - в 72.5% (диаграмма 11). Вслизистой шейки матки двойная окраска не определяется при хроническомцервиците, экспрессируется только маркер пролиферации Ki67 в виде красногоцвета в цитоплазме. А при ЦИН<II, ЦИН≥II и микроинвазивной карциноме, кромеKi67, еще p16 экспрессируется в ядре коричневым цветом (рис.27).

Клетки сдвойной окраской определяются в слизистой шейки матки в 12.5%, 67.5% и 82.5%всех клеток слизистой шейки матки при ЦИН<II, ЦИН≥II и микроинвазивнойкарциноме (Диаграмма.12).87Рисунок 27. Двойная окраска при MSCC, ИГХ с использованием двух антител р16 и Ki67, ×200100%93%70%90%Ki6773%80%60%73%70%p1670%55%60%45%40%40%50%C-MYCp5350%HIF-140%25% 35%VEGF30%30%20%20%10%10%0%0%0%репаративные СЭМСнеопластические СЭМСраковые СЭМСДиаграмма 11 Экспрессия онкомаркѐров в СЭМС разных видов, Различия достоверны – P<0.0588100%82.50%90%80%67.50%70%82.50%67.50%60%p1650%Ki6740%30%20%10%10%12.50%12.50%0.00%0%ChCerЦИН<IIЦИН≥IIMSCCДиаграмма 12 Экспрессия p16 и Ki67 в слизистой шейки матки приВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки.Изучение экспрессии онкомаркера C-MYCC-MYC выявлялись в виде коричневого окрашивания в цитоплазме клеток иопределялись в 30% эпителиальных клеток СЭМС 1 вида, в 45% и 55% клетокСЭМС 2 вида и 3 вида соответственно (рис.28, см.

диаграмма 11). C-MYC такжеэкспрессировались в окружающих тканях эпителия шейки матки: в 11% клетокпри хроническом цервиците, в 17.5% клеток при ЦИН<II, в 45% клеток приЦИН≥II и в 45% при микроинвазивной карциноме. Экспрессия C-MYC во всемпласте слизистой, увеличивалась со степенью злокачественности патологиишейки матки (Диаграмма 13).89Рисунок 28 Экспрессия C-MYC в СЭМС при ЦИН≥II, ИГХ с использованиемантител к C-MYC, ×400C-MYC в эпителии слизистой шейки матки100.00%83.75%90.00%80.00%70.00%60.00%45.00%50.00%40.00%30.00%20.50%25.00%20.00%10.00%0.00%ChCerЦИН<IIЦИН≥IIMSCCДиаграмма 13 Экспрессия C-MYC в эпителии слизистой шейки матки приВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки.90Изучение экспрессии онкомаркера p53При иммуногистохимическом исследовании с антителами к маркеру p53 былавыявлена ядерная экспрессия белка в плоскоклеточном эпителии, криптах шейкиматки, особенно в СЭМС 2 вида и 3 вида (рис.29,30).P53 не обнаруживался в эпителиальных клеток СЭМС 1 вида, выявлялся в 10%эпителиальных клеток неопластических СЭМС.

Обнаруживался р53 в 70%эпителиальных клеток СЭМС 3 вида (Диаграмма11). В целом в эпителиальномпласте маркер не определялся при хроническом цервиците и при ЦИН<II. ПриЦИН≥II р53 определялся в 7.5% клеток, а при микроинвазивной плоскоклеточнойкарциноме шейки матки - в 52.5% всего эпителиального пласта (Диаграмма14). Вокружающем сфероиды ткани p53 экспрессируется при ЦИН≥II (в 5% клеток) ипри микроинвазивной плоскоклеточной карциноме шейки матки (в 35% клеток)(Диаграмма 15).Таким образом, на основании всех полученных данных и данных литературы[Wang N, Yao Q, Li X, 2004; Kogan E A, Fayzullina N M, Demura T A, 2013], былоустановлено, что процесс канцерогенеза в шейке матки связан с формированиемСЭМС, которые могут быть разделены на 3 вида в соответствии симмунофенотипом, участием в репаративных процессах и опухолевом росте:репаративные СЭМС, не экспрессирующие р16 и р53; неопластические СЭМС,экспрессирующие р16 и р53 в единичных клетках; и раковые СЭМС с высокойэкспрессией клетками р16 и р53.91В результате проведенного исследования установлено, что высокая экспрессияр53(70,0%)вэпителиальныхклетокСЭМСпозволяетпроводитьдифференциальный диагноз между ЦИН≥II и MSCC шейки матки, что совпадаетс данными других авторов.