Диссертация (Репаративные и предраковые процессы при ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки)

Министерство здравоохранения Российской Федерациигосударственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образованияПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙУНИВЕРСИТЕТ имени И.М. СЕЧЕНОВАНа правах рукописиЛи ЦзяцзинРепаративные и предраковые процессы приВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки/14.03.02.-«Патологическая анатомия»/Диссертация на соискание ученой степеникандидата медицинских наукНаучный руководитель:профессор кафедры патологической анатомииимени академика А.И.Струковалечебного факультетаКоган Евгения АлександровнаМосква - 20161СПИСОК СОКРАЩЕНИЙВПЧ – вирус папилломы человекаДНК - дезоксирибонуклеиновая кислотаИГХ – иммуногистохимияИЦХ – иммуноцитохимияНСК – ниша стволовой клеткиПЦР-НВ - полимеразная цепная реакция в настоящем времениРСК – раковая стволовая клеткаРШМ – рак шейки маткиСЭМС – сфероидная эпителиально-мезенхимальная структураЦИН - цервикальная интраэпителиальная неоплазияALDH 1 – альдегиддегидрогеназа 1ASC-US – клетки плоского эпителия с атипией неясного генезаChCer – хронический цервицитC-MYC – ген семейства myc СHIF-1 – фактор, индуцируемый гипоксией 1 альфаH-SIL – плоскоклеточные интраэпителиальные поражения высокой степениKi-67 – маркер пролиферацииL-SIL – плоскоклеточные интраэпителиальные поражения низкой степениMSCC – микроинвазивная плоскоклеточная карциномаNFKB – ядерный фактор «каппа-би»2NILM – негативные в отношении интраэпителиального поражения илизлокачественностиOct-4 – octamer-binding transcription factor 4, транскрипционный фактор,содержащий гомеобокс 4P16 – р16 (INK4A)Rb – Гено-супрессор ретинобластомыROC – receiver operating characteristicVEGF – Эндотелиальный фактор роста сосудовVim – Vimentin3ОГЛАВЛЕНИЕВВЕДЕНИЕ …………………………………………………………………………....6ГЛАВА 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………………….141.1. Эпидемиология РШМ ……………………………………….......................141.2. Этиология РШМ ……………………………………………………………..151.3. Патогенез РШМ ………………………………………………………………....181.3.1 Роль ВПЧ в канцерогенезе РШМ ……………………………………………..181.3.2 Роль раковых стволовых клеток в канцерогенез РШМ ……………………...211.4.

Морфологическая характеристика предрака и рака шейки матки …………..251.4.1. Зона трансформации шейки матки – ниша стволовых клеток шейкиматки ………………………………………………………………………….………251.4.2. Классификация предрака шейки матки …………………………………..261.4.3. Сфероидные структуры …………………………………………………….…271.5. Методы морфологической диагностики, ВПЧ-тестирование, кольпоскопия искрининг РШМ ……………………………………………………………………….29ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ …………………...452.1.Материал исследования …………………………………………...…................452.2.

Методы исследования ……………………………….……………….................48ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ……………………………….…533.1. Ранняя диагностика ВПЧ-ассоциированных рака и предрака шейки матки уженщин до 30 лет и старше ………………….……………………………......5343.2. Определение эффективности комплексной диагностики предрака и ракашейки матки с использованием: жидкостной цитологии, двойногоиммуноокрашивания p16/Ki67 и ПЦР-НВ…………………….……..673.3. Изучение репаративных, неопластических и раковых сфероидныхструктур при ВПЧ-ассоциированном предраке и раке шейки матки:морфологические и иммунофенотипические особенности …….….77ЗАКЛЮЧЕНИЕ ……………………………………………………………………111ВЫВОДЫ …………………………………………………………………………...121ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ……………………………………….....122СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………………………………..1235ВВЕДЕНИЕРак шейки матки (РШМ) является одной из наиболее распространенных формонкологическойпатологииженщин,занимая7-еместосредивсехзлокачественных опухолей.

Среди злокачественных опухолей у женщин частотаРШМ составляет 9,8% [16]. Многолетними исследованиями установлено, что вэтиологии предрака и рака шейки матки большое значение имеет вируспапилломы человека (ВПЧ), принадлежащий к семейству papova viridae иимеющий тропность к многослойному плоскому эпителию [25]. Большинствоученых считают, что при ВПЧ-инфекции онкобелки вируса Е6 и Е7 приводят кгенетической нестабильности и эпигенетическим нарушениям инфицированныхклеток, вследствие чего запускается процесс канцерогенеза и развития РШМ [126].ВПЧ был обнаружен практически в 99.8% случаев инвазивной карциномы шейкиматки и более чем в 60% случаев цервикальной интраэпителиальной неоплазии(ЦИН) [127].

От момента первичной вирусной инфекции до развития РШМпроходит достаточно длительный срок – 5–10 лет, поэтому профилактику РШМможно проводить не только путѐм предотвращения заражения ВПЧ-инфекцией(вакцинацией), но и путѐм ранней диагностики предраковых процессов исистемного скрининга. В тех странах, где проводится вакцинация, где качество ираспространенность скрининга высоки, отмечается снижение частоты развитияинвазивного рака шейки матки на 90% [5].На сегодняшний день вопросы о периодичности проведения скрининга,использованиямаркѐровиметодовдиагностикиРШМ,особеннопри6транзиторной инфекции, остаются открытыми.

Американское общество покольпоскопии и патологии шейки матки рекомендует начинать программускрининга РШМ с возраста женщин от 21 года. В Дании возраст начала скринингаРШМ составляет 23 год, во Франции – 25 лет, в Финляндии – 30 лет. Вопрос обособенностях проведения скрининга РШМ у женщин до 30 лет и старше 30 летостается дискуссионным. Для проведения эффективного скринингового теста иранней диагностики РШМ необходимо найти методы, обладающие высокойспецифичностью и чувствительностью.

В странах с организованным скринингомРШМ, основанным на цитологическом исследовании, было показано снижениезаболеваемости и смертности от РШМ [21].При цитологическом исследовании выявляется большое количество пациентовс ASC-US (клетки плоского эпителия с атипией неясного генеза), L-SIL(плоскоклеточныеинтраэпителиальныепоражениянизкойстепени)сотносительно низким риском развития РШМ. Выявление у пациентов H-SIL(плоскоклеточные интраэпителиальные поражения выcoкoй степени) требуетдальнейшегообследования[60].Установленочтовдифференциальнойдиагностики данных изменений важную роль играют иммуногистохимические(ИЦХ) и иммуноцитохимические (ИЦХ) исследования с использованием двойныхантител к р16/Ki67. ВПЧ-тестирование показало свою эффективность прискрининге женщин с ASC-US и L-SIL, однако, было обнаружено, что убольшинства женщин до 30 лет ВПЧ-инфекция носит нестабильный характер7[83,131], что ограничивает использование данного метода, как основного длявыявления предраковых изменений шейки матки.Канцерогенез РШМ в настоящее время рассматривается с точки зренияобразованияраковыхстволовыхклеток(РСК)исфероидныхэпителиально-мезенхимальных структур (СЭМС) в тканях [11].

Сфероидныеструктуры впервые были описаны в культурах стволовых клеток, они активноиспользуются в тканевых принтерах для воссоздания тканей. В 1992г. былапродемонстрирована пролиферация клеток, выделенных из полосатого телаголовного мозга мышей, под воздействием фактора роста in vitro, а такжеформирование данными клетками сфероидных структур [98]. Похожие СЭМС,включающие раковые стволовые клетки, обнаруживаются in vivо при предраке ираке простаты [50], молочных желез [92], яичников [139]. В шейке матки приВПЧ-ассоциированном хроническом цервиците и ЦИН было обнаруженоформирование СЭМС в плоском эпителии и экспрессия клетками СЭМС маркераэмбриональных стволовых клеток Oct-4 [11].

Однако участие СЭМС врепаративных процессах и канцерогенезе РШМ остается не до конца изучено.Цель исследованияОценить эффективность цитологического, иммуноцитохимического методов иВПЧ-тестирования для выявления предрака и рака шейки матки, а также изучитьпатологические, морфологические и молекулярно-генетические особенностипроцессов репарации и злокачественной трансформации эпителия шейки матки нафоне ВПЧ-инфекции.8Задачи исследования1) Сравнить чувствительность и специфичность цитологического метода иВПЧ-тестирования методом ПЦР-НВ при ранней диагностике предрака и ракашейки матки у женщин до и после 30 лет.2) Оценить эффективность комплекса методов ранней диагностики предрака иракашейкиматкиуженщин:жидкостнойцитологии,двойногоиммуноокрашивания p16/Ki67 и ВПЧ-тестирования методом ПЦР-НВ.3) Оценить морфологические и ИГХ характеристики СЭМС разных видов,обнаруженныхприрепаративныхипредраковыхВПЧ-ассоциированныхпатологических процессах в шейке матки.4) Определить наиболее значимые дифференциренциально-диагностическиеморфологическиепризнакиимолекулярныемаркерырепаративныхипредраковых процессов на фоне ВПЧ-инфекции.Научная новизна предлагаемой темы по литературным источникам ипатентной документации.Проведенное исследование показало, что канцерогенез и морфогенезВПЧ-ассоциированногоплоскоклеточногоракашейкиматки-этомногостадийный процесс, который связан с последовательным развитиемструктурных изменений, характеризующихся образованием Оct4-позитивныхрепаративных, неопластических и раковых СЭМС.Репаративные СЭМС встречаются при хроническом цервиците и ЦИН<II,характеризуются отсутствием клеточного атипизма и экспрессии р16, р53, CD34,9выявляется низкая экспрессия маркера пролиферации Ki67, маркера стволовостиALDH1, и умеренная экспрессия Vim, онкомаркера C-MYC, а также маркерагипоксии HIF-1.Неопластические СЭМС встречаются при ЦИН<II и ЦИН≥II, их клеткихарактеризуются признаками клеточного атипизма, отсутствием экспрессии CD34,низкойэкспрессиейонкомаркерар53,умереннойэкспрессиеймаркерапролиферации Ki67, онкомаркерар16, маркера стволовости ALDH1, и высокойэкспрессией C-MYC, Vim, маркера гипоксии HIF-1.Раковые СЭМС обнаруживаются при микроинвазивной плоскоклеточнойкарциноме, они формируются вне зависимости от расположения сосудов инередко сливаются в крупные конгломераты.

Раковые СЭМС построены израковых клеток и характеризуются высокой экспрессией маркера пролиферацииKi67, онкомаркеров р16, C-MYC, р53, маркеров стволовости ALDH1, CD34, Vim,и маркера гипоксии HIF-1.В неопластических и раковых СЭМС определяются атипичные клетки,экспресирующие одновременно онкомаркеры и маркеры стволовости.Практическая значимостьУстановлено, что для ранней диагностики и скрининга ВПЧ-ассоциированнойпатологии шейки матки следует использовать комплекс методов: жидкостнуюцитологию, ВПЧ тестирование методом ПЦР-НВ и ИЦХ с двойной окраскойр16/Ki67 - это значительно повышает их чувствительность и специфичность.Скрининг РШМ у женщин моложе 30 лет должен начинаться с жидкостной10цитологии, старше 30 лет – с ВПЧ тестирования, что определяется эволюциейпатологического процесса и экономическими факторами.Основные положения, выносимые на защиту1.