Диссертация (Морфофункциональные изменения печени при острой тонкокишечной непроходимости), страница 8

Последнюю группу методовсоставил статистический анализ полученных данных.2.2.1. Методика постановки экспериментов. Моделирование разныхвидов тонкокишечной непроходимостиЭкспериментальнаячастьпроведенассоблюдениемасептикииантисептики и под наркозом. Собакам для обеспечения наркоза вводили 2,5%раствор тиопентала натрия из расчета 0,4-0,5 мл на 1 кг массы тела животного. Входе эксперимента выполнялось моделирование различных видов остройтонкокишечной непроходимости (рис.2.1)1235III4Рисунок 2.1. Схема моделирования различных видов кишечной непроходимостиI -Странгуляционная тонкокишечная непроходимостьII -Низкая обтурационная тонкокишечная непроходимость1-Верхняя брыжеечная артерия2-Верхняя брыжеечная вена3-Начальный отдел тощей кишки4-Подвздошная кишка5-Слепая кишкаОбработав кожные покровы, срединным разрезом вскрывали брюшиннуюполость и накладывали лигатуру капроновой нитью № 5 на петлю тонкой кишкидлиной 15 см в среднем ее отделе на 100 см проксимальнее подвздошнослепокишечногоперехода,такимобразоммыформировалистрангуляционную тонкокишечную непроходимость (рис.

2.2, 2.3).49оструюРисунок 2.2.Модель острой странгуляционной тонкокишечной непроходимости.Рисунок2.3.Модельостройстрангуляционнойтонкокишечнойнепроходимости (интраоперационная макроскопическая картина).50Накладывая капроновую лигатуру на тонкую кишку без сдавления брыжейкикишки на 100 см проксимальнее подвздошно-слепокишечного угла мыформировали низкую обтурационную кишечную непроходимость (рис.

2.4, 2.5)Рисунок 2.4. Модель острой обтурационной тонкокишечной непроходимости.Рисунок2.5. Модель острой низкой обтурационнойтонкокишечнойнепроходимости (интраоперационная макроскопическая картина).51Моделированиестрангуляционнойтонкокишечнойнепроходимостивыполнено со сроками наблюдения 3, 6, 12 и 24 ч и низкой обтурационной сосроками наблюдения 1, 2, 3 и 6 суток с последующим выведением животных изэксперимента (по 12 собак на каждый блок).2.2.2. Методы исследования печени2.2.2.1. Гистологические методики исследованияДля изучения морфологии печени в норме, при моделировании ОТКН и вконтрольной группе сразу же после выведения животного из эксперимента дляприготовления гистологических препаратов иссекали участок ткани печени изпереднего края правой доли размером 2*3 см.

Кусочки фиксировали в жидкостиКорнуа, а затем – в 12% нейтральном формалине и, после соответствующейпроводки по спиртам восходящей концентрации, заливали в парафин. Изматериала, залитого в парафин, готовили срезы толщиной 5-7 мкм. Срезыокрасили гематоксилином и эозином, по Эйнарсону, методом ШИК-реакции.2.2.2.2. МорфометрияПри помощи микроскопа «Axioplan 2 Imaging» (Carl Zeiss), с цифровойкамерой (на увеличении в 400, 640 раз) мы изучали готовые микропрепаратыпечени.

Такого типа микроскоп, вместе с одним из графических редакторов«AxioVision Rel 40», позволяет преобразовать получаемое изображение вцифровой вариант (переносить изображение на монитор компьютера). Пререводизображения в цифровой вариант производился по такому алгоритму:Workarea=> Scaling (40*1388) => MosaiX=> Acquisition=> Columns10, Rows 10,Overlap(%)-15=> Start. Далее MosaiX=> Stitching=> SobelSize(High)=> Start.Последним этапом в переводе фотографии в цифровой вариант являлось52сохранение фотографии в формате jpeg, для этого применяли алгоритм: ConvertThe Image=> New image(off)=> Out put=> Zoom(100) => название фотографии=>Applay=> OK.Для морфометрического исследования сосудов гемомикроциркуляторногорусла печени применяли графический редактор «Adobe Photoshop CS3 ExtendedRUS», и морфометрическую программу «ImagePro 6.0».После загрузки исследуемого изображения (разрешение 150 пикс/дюйм) вграфическом редакторе Adobe Photoshop CS3 Extended RUS, дополнительнозагружали изображение с готовым квадратом (размер изображения: высота иширина-по 195 мм, разрешение 150 пикс/дюйм).

При помощи инструмента“Перемещение” перетаскивали квадрат на исследуемое изображение. Спомощью этого квадрата-рамки на срезе в ручном режиме выделялисьинтересующие области.После в столбце «слой» выбирали пункт «выполнитьсведение», далее в столбце «файл» выбирали «сохранить как» и сохранялиизображение в отдельной папке.Применялиморфометрическийметодоценкиизмененияобъемасосудистого русла по степени изменения площади (междольковых артерий,междольковых вен, центральных вен) в гистологическом препарате на квадратеплощадью 600х103мкм. Для этого применялась морфометрическая программа«ImagePro 6.0».

Загружалось изображение с сохраненными квадратамиопределенной площадью (600х103мкм2). Проводили горизонтальную линию наизображении исследуемого материала, для определения стороны квадрата,нажав и не отпуская левую кнопку мыши (предварительно выбрав «линейку40x1388» в столбце «Apply»). Необходимо следить, чтобы линия была строгогоризонтальная, об этом можно судить по нулевым показателям высоты и угла(«В:», «У:» на панели «линейки»).

Удостоверившись в правильности размеровквадрата, начинали подсчет площади сосудов. На препаратах одной серии длякаждого звена микроциркуляторного русла производили не менее 50-тиизмерений. При выделении сосуда программа автоматически высчитывала его53площадь. В столбце «Measurments» выбирали инструмент «Trace» и считалиплощадь интересующих нас сосудов.Коэффициент соотношения объема сосудистого русла воротной системы,системы собственной печеночной артерии и системы печеночных вен(центральных вен долек печени) рассчитывается на основе сравнения расчетнойвеличины общего радиуса сосудистого русла на основе применения формулыS=πr2,где S-площадь сосудистого русла в выбранной стандартной площадипрепарата.Расчетная величина общего радиуса сосудистого русла междольковых вен(междольковых артерий, центральных вен долек) печени основана назаключении об однотипном строении и организации ветвления сосудистойсистемы воротной вены и системы собственной печеночной артерии,являющихся сосудами-спутниками, имеющими, соответственно, общую длинумагистралей и ветвей, но имеющими разный диаметр (радиус) просвета сосудови, следовательно, разный объем сосудистого русла (бассейна).Для оценки пластических процессов применяли метод выявлениясуммарных нуклеопротеидов по Эйнарсону.

Морфометрия производилась спомощью программы «Adobe Photoshop CS3 Extended RUS», «Image3,0». Напрепаратах одной серии производили не менее 30-ти измерений.После загрузки исследуемого изображения (разрешение 150 пикс/дюйм) вграфическом редакторе Adobe Photoshop CS3 Extended RUS, дополнительнозагружали изображение с готовым квадратом-рамкой (размер изображения:высота и ширина- по 8 см, разрешение 150 пикс/дюйм).инструмента“Перемещение”перетаскиваликвадратнаПри помощиисследуемоеизображение. С помощью этого квадрата - рамки на срезе в ручном режимевыделялись интересующие области. После в столбце «слой» выбирали пункт«выполнить сведение», далее выбирали инструмент «ластик» и удаляли ненужные нам клетки (лейкоциты, клетки Купфера, эндотелиальные клетки) для54достоверности результатов.

Далее нажав на инструмент «прямоугольнаяобласть» вырезали обработанный квадрат с необходимым изображением иперемещали его на чистую страницу в формате JPEG, изображение сохраняли вформате JPEG.Для измерения площади которую занимают продукты цитохимическойреакции имеющих определенную интенсивность окраски на ед. площади 7500мкм2 применялась морфометрическая программа « Image3,0».

В программе«Image3,0» загружали исследуемое изображение. На первом этапе изображениепреобразовывалосьвчерно-белыйрежим.Производитсявыделениесоответствующего цветового диапазона и подсчитывается количество пикселейданного цвета на заданной площади.Нажав на инструмент «Автоопределениеобъектов» выбирали цветовую границу (80 пикс), далее нажав на инструмент«Конфигурация» выбирали параметры: - выделять прямоугольником, - выводитьномера объектов, - не учитывать размеры на площади меньше, чем 1 точка, учитывать цвета слева от указателя. Последним этапом, выбрав инструмент«Вычислить объекты», в автоматическом режиме вычислялись все необходимыеобъекты. Автоматически на экран выводилась таблица с рассчитаннымиданными, которые сохранялись в программе EXEL.Оценку содержания гликогена в печени определяли по результатамколичественной оценки продуктов ШИК – реакции (PAS-Periodic Acid Schiffreaction).

Морфометрия производилась с помощью программы «Adobe PhotoshopCS3 Extended RUS», «Image3,0». На препаратах одной серии производили неменее 30-ти измерений. После загрузки исследуемого изображения (разрешение150 пикс/дюйм) в графическом редакторе Adobe Photoshop CS3 Extended RUS,дополнительно загружали изображение с готовым квадратом-рамкой (размеризображения: высота и ширина - по 12 см т.к. калибр 640х1388, разрешение 150пикс/дюйм).