Диссертация (Морфофункциональные изменения печени при острой тонкокишечной непроходимости), страница 9

При помощи инструмента “Перемещение” перетаскивали квадратна исследуемое изображение. После в столбце «слой» выбирали пункт«выполнить сведение», далее выбирали инструмент «ластик» и удаляли не55нужныенамклетки(ядрагепатоцитов,лейкоциты,клеткиКупфера,эндотелиальные клетки) для достоверности результатов. Далее нажав наинструмент «прямоугольная область» вырезали обработанный квадрат снеобходимым изображением и перемещали его на чистую страницу в форматеJPEG, изображение сохраняли в формате JPEG.Для измерения площади, которую занимают продукты цитохимическойреакции, имеющие определенную интенсивность окраски, на ед.

площади 7500мкм2, применялась морфометрическая программа «Image3,0». В программе«Image3,0» загружали исследуемое изображение. На первом этапе изображениепреобразовывалосьвчерно-белыйрежим.Производитсявыделениесоответствующего цветового диапазона и подсчитывается количество пикселейданного цвета на заданной площади.Нажав на инструмент «Автоопределениеобъектов» выбирали цветовую границу (135 пикс), далее нажав на инструмент«Конфигурация» выбирали параметры: - выделять прямоугольником, - выводитьномера объектов, - не учитывать размеры на площади меньше, чем 1 точка, учитывать цвета слева от указателя.

Последним этапом, выбрав инструмент«Вычислить объекты», в автоматическом режиме вычислялись все необходимыеобъекты. Автоматически на экран выводилась таблица с рассчитаннымиданными, которые сохранялись в программе EXEL.2.2.2.3.Гистохимические методики исследованияГистохимическиеметодыисследованияявляютсяоднимиизфундаментальных методов цитохимии, широко используемых в медицине. Ониоснованы на использовании реакций, с помощью которых выявляют химическиевещества в клетках тканей и органов.

Зная о том, как распределяются в печенибелки, жиры, углеводы, ферменты и другие вещества в норме и при ОТКН,можно будет судить о направленности метаболических процессов в печени.Выявление этих веществ основано на специфичности реакций между56химическим реактивом и субстратом, входящим в состав клеточных и тканевыхструктур, и на выделении продуктов химических реакций в виде окрашенныхосадков.

С помощью различных гистохимических методов исследования можновыявить вещества, показывающие функциональную активность клеток печени.Применение гистохимических методик продиктовано необходимостью изучениясостояния обменных процессов в печени после моделирования ОТКН вразличные сроки. Современные гистохимические методы обнаруживают вклетках аминокислоты, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды,витамины, минеральные и другие вещества, определяют активность различныхферментов, например, в цикле Кребса. Чтобы повысить специфичность реакций,часто применяют метод ферментативного контроля.

Так, например, длявыявления ДНК и РНК используют галлоцианин - хромовые квасцы,окрашивающие нуклеиновые кислоты в серовато-синий (темно-синий) цвет,цитоплазму в серый, остальные клеточные структуры бесцветные. Призначениях рН от 1,5 до 1,7 специфичность связывания красителя снуклеиновымикислотамидостаточновелика.Данныйметодвыявляетодновременно ДНК и РНК. Для оценки уровня метаболизма производилиопределение содержания суммарных нуклеиновых кислот по методу Эйнарсона– реакции с галлоцианин - хромовыми квасцами. Сравнение уровнянуклеопротеидного обмена гепатоцитов с нормой будет характеризоватьнапряженностьобменныхпроцессовпечени.Окраскупроводилинапарафиновых срезах после фиксации материала в жидкости Карнуа.Результаты реакций оценивали количественно с помощью количественнойцитоспектрофотометри и компьютерных программ, позволяющих оценитьплощадь, которую занимают продукты цитохимической реакции имеющихопределенную интенсивность окраски на единицу площади.Гистохимическим методом выявления гликогена в печени является реакцияс Шифф-йодной кислотой (ШИК-реакция).

В состав реактива Шиффа входиткрасный краситель (основной фуксин), благодаря ему ШИК-положительные57соединения (гликоген) избирательно окрашиваются в красновато-лиловые тона.Относительное определение продуктов гистохимической реакции на единицуплощади ткани печени позволяет выявить изменение содержания гликогена посравнению с нормой.2.2.2.4.Количественная оценка результатов цитохимических реакцийЦитоспектрофотометрия (цитофотометрия) – является спектральным методомкак количественного так, и качественного изучения химических веществ клеткив зависимости от ее избирательного поглощения видимых, ультрафиолетовых иинфракрасных лучей.

Спектр поглощения клетки прежде всего определяетсясоставом клетки, теми компонентами, из которых она состоит. Спектр несетинформацию о состоянии клетки, так как при изменении состояния клеткиизменяется ее состав и, соответственно, оптический спектр.Применив эту методику можно установить содержание белков, углеводов идругихэлементовклетки.Методоснованнапринципеабсорбцииспектрофотометрии. Например, сухую массу можно оценить с помощьюинтерферометрии, а также концентрацию плотных веществ как в живой, так и вфиксированной клетке.Поскольку реакции между исследуемым субстратом, который входит в составклеток и тканей и химическим реактивом высокоспецифичны, продуктыцитохимических реакций, выделенных в виде окрашенных осадков, такжеотличаются высокой специфичностью.Учитывая, что доля пигментов на единицу площади нами исследуемыхобъектов характеризует количество продуктов цитохимической реакции вданной же площади, следовательно, площадь, которую занимают продуктыцитохимической реакции на единицу площади гистологического среза вобъектах исследования, будет пропорциональна количеству субстрата, которыйвступает в реакцию.

Она будет характеризовать количество химического58вещества в структурных компонентах клеток тканей и органов, которые мыизучаем.Измеривплощадьсопределеннойцветовойграницей,соответствующей цветовой границе примененного гистохимического маркера,можно получить относительную количественную характеристику химическогосубстрата. В динамике развития заболевания, проследив за этими процессами втканях и органах, можно достоверно определить направленность этихизменений.Для измерения площади можно применять любую морфометрическуюпрограмму,позволяющуюпроводитьсегментациюобъекта.Внашемисследовании использовалась программа «Image-3,0», и графический редакторAdobe Photoshop CS3 Extended RUS.

Фотосъемка препаратов производилась намикроскопе «Axioplan 2 Imaging» (Carl Zeiss), с цифровой камерой (наувеличении в 400, 640 раз). Такого типа микроскоп, вместе с одним изграфических редакторов «AxioVision Rel 40», позволяет преобразоватьполучаемое изображение в цифровой вариант (переносить изображение намонитор компьютера).2.3.Статистическая обработка и корреляционный анализ полученныхрезультатовСтатистическуюобработкуикорреляционныйанализрезультатовпроводили методами вариационной статистики в программах «Statistica 6.0.(StatSoft Inc., США)», «AtteStat».

Перед проведением статистического анализаполученные количественные данные проверили на характер распределенияслучайных величин с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Дальнейшаяобработка данных проводилась с помощью непараметрических методов. Дляэтого в программе «Statistica 6.0.

(StatSoft Inc., США)» на панели инструментовдля создания документа выбирали «New-новый», далее выбирали «Number59числовой», после создания документа, скопировав таблицу с результатамиисследования вставляли ее в этот документ нажав на правую кнопку мыши«paste-вставить». Для статистического анализа данных в графе «Statisticsанализ» выбирали пункт «basik statistics-основные статистические таблицы»,далее выбирали пункт «descriptive statistics –описательная статистика», далее«OK», на экране появлялась таблица, выбрав графу «Advanced-дополнительно»,ставилигалочкинапротивнеобходимыхнампунктов:«Valid-N-числонаблюдений», «Median-медиана», «Lower and upper quartiles- нижний и верхнийквартиль».Нажав на графу «Quick-быстрый» в этой же таблице, выбирали«Variable- переменные» с 1 по 5.

Для анализа данных в этой же таблицевыбирали графу «Summary: Descriptive Statistics-подробная статистика». Длясохранения полученных данных в программе «Exel» нажимали на таблицуправой кнопкой мыши и выбирали пункт «Copy with Headers». Для созданияграфика к полученным данным, необходимо нажать графу «Descriptive Statisticsописательная статистика». При появлении коробчатых диаграмм, нажав левойкнопкой мыши на экран, выбирали графу «Box and whisker plotfor all variableдиаграмма размаха», далее выбирали графу «Box/Whister-диаграмма размаха».Для того, чтобы в диаграммах были медианы выбирали графу «Median», далледля удобства перемещали названия (Median; 25%-75%; Non-Outlier Range) всередину экрана, нажав на правую кнопку мыши выбрав «Convert to floating textплавающий текст»,далее «Convert To Title-конвертировать в заголовок»,«ConverttoSubtitle-конвертироватьвподзаголовок».Дляобозначенияпечеменных в таблице нажимали на «Var 1», далее выбирали графу «CustomUnits» и к каждой переменной вписывали название (норма, через 3 часа, через 6часов и т.д.).

Для сохранения диаграммы нажимали правой кнопкой мыши наэкран и выбирали «Save Graph», давали имя файлу, и выбирали тип файла«JPEG».60Статистическиепоказателиприведеныввидемедианы(Me)иинтерквартильного размаха: Me (25L;75U) и сравнивались с помощью критерияКоновера.Для множественного сравнения загружали программу «AtteStat» впрограмму «Exel». Открыв программу «Exel», выбирали графу «Надстройки»,далее выбирали «AtteStat», из предложенно списка выбирали «Дисперсионныйанализ», на экране появлялась таблица, в которой необходимо выбрать нужныенам параметры. Нажав левой кнопкой мыши на графу «Интервал данных или 1выборки для множественных сравнений» мы выделяли необходимые данные вдокументе для множественного сравнения инажимали «ОК».