Диссертация (Микробная колонизация нижних дыхательных путей и её влияние на развитие нозокомиальных пневмоний у онкохирургических больных в отделениях интенсивной терапии), страница 3

Параллельно из инокулята делали высев наплотные питательные среды для проверки чистоты культуры.15Инокулированные чашки инкубировали в атмосферных условиях притемпературе 350 С в течение 18-20 часов. Чашки с агаром Мюллера-Хинтона II сдобавлением 5% крови инкубировали в СО2-инкубаторе. При определениичувствительности использовали стандартизированные качественные диски фирмBio-RadTM и BDTM (США). Интерпретация значений диаметров зон задержкироста при определении чувствительности микробов к антимикробным препаратампредставлена в таблице 1.Учитывая то, что у выбранного метода определения чувствительностимикробов к антибактериальным препаратам имеется ряд ограничений, вчастности, общепризнана недостаточная разработанность метода для оценкичувствительности микробов со сложными питательными потребностями имедленнорастущих,дляинтерпретациирезультатовмикробиологическогоисследования биологических свойств выделенных штаммов госпитальноймикрофлоры, использовали автоматизированную систему «OSIRIS» фирмыBIORAD Laboratories (США).Предлагаем использовать эту систему тогда, когда нет возможности купить иобслуживать дорогие автоматические и полуавтоматические микробиологическиесистемы, использующие для определения антибиотикорезистентности микробовразличные варианты метода серийных разведений.

В этом случае, для исключенияполучения ошибок при использовании диско-диффузионного метода определениячувствительности УПМ рекомендуется использовать «OSIRIS».Таблица 1.Интерпретация значений диаметров зон задержки роста [30 ,79, 80]Антибактериальные препаратыСодержание вдиске (мкг)АзитромицинHemophilus spp.АмикацинДиаметр зон для культур (в мм.)резистен-умеренночувствительнтныхрезистентныхых15——>1230<1415-16>1716АмпициллинEnterobacteriaceae10Hemophilus spp.<1314-16>17<1819-21>22Ванкомицин30——>15Гентамицин10<1213-14>15Имипенем/циластатин10<1314-15>16<1011-15>16<1516-18>162<1415-20>21Карбенициллин100<1314-16>17Меропенем10<1314-15>16Оксациллин1<1011-12>13Офлоксацин5<1213-15>16Пиперациллин100<17—>18Полимиксин В300<89-11>125<1617-19>20Enterobacteriaceae30<1415-18>19Hemophilus spp.30<2526-28>29S.

pneumoniae30<1819-22>23Тобрамицин10<1213-14>1530<2526-28>29Цефазолин30<1415-17>18Цефепим30<1415-17>18Цефоперазон75<1516-20>21Цефтазидим30<1415-17>18Цефтриаксон30<1314-20>21<1415-22>23——>26<1516-20>21——>21Ко-тримоксазол (бисептол)Hemophilus spp.S. pneumoniaeКлиндамицинРифампин1,25/23,75ТетрациклинХлорамфениколHemophilus spp.ЦефотаксимHemophilus spp.ЦипрофлоксацинHemophilus spp.30517Эритромицин15S.

pneumoniae<1314-22>23<1516-20>21Выявление резистентности к метициллину (оксациллину) S. aureus методомскринингаДля определения чувствительности использовали оксациллин ввиду его болеевысокойстабильностиприхранениипосравнениюсметициллином.Использовали чистые культуры S. aureus, инкубированные в течение 18-24 часовна кровяном агаре, агар Мюллера-Хинтона с 4% NaCl с добавлением субстанцииоксациллина с известной активностью. Наносили бактериальную взвесь S.

aureusс мутностью 0,5 по МакФарланду (1,5х108 КОЕ/мл) на поверхность агара соксациллином. Штаммы S. aureus инкубировали при температуре 350 С в течениеполных 24 часов. Исследование проводили при обязательном контроле ростаиспытуемых культур на агаре Мюллера-Хинтон с 4% NaCl без оксациллина(культуру наносили так же, как на агар с оксациллином). Использоваликонтрольные штаммы S. aureus АТСС 38591 — резистентный к оксациллину, S.aureus АТСС 29213 — чувствительный к оксациллину.

При появлении видимогороста более 1 колонии на месте нанесения культуры означало устойчивостьданного штамма к оксациллину (метициллину), при отсутствии роста на местенанесения культуры исследуемый штамм считали чувствительным к оксациллину(метициллину).расценивалиМетициллинокак(оксациллино)резистентныековсемрезистентныев-лактамнымстафилококкиантибиотикам:пенициллинам, цефалоспоринам, карбапенемам, комбинациям пенициллинов сингибиторами в-лактамаз.Выявление в-лактамаз расширенного спектра у грамотрицательных бактерийс помощью фенотипических методовПослерутинногоизученияштаммыграмотрицательныхбактерий,резистентные к трём и более антибактериальным препаратам, имеющие МПК кхотя бы одному из цефалоспоринов 2,0 мкг/л и более, резистентные к18цефалоспоринам III поколения, отбирались для дальнейшего изучения. Методдвойных дисков применялся для подтверждения БЛРС-фенотипа энтеробактерийи выявления штаммов P. aeruginosa, подозрительных на продукцию МБЛ.

Методпредставляетсобойвариантклассическогодиско-диффузионногометодаопределения чувствительности к антибиотикам, который позволяет выявитьпродукцию БЛРС по наличию расширенной зоны подавления роста вокруг диска скаким-либо цефалоспорином III поколения напротив диска, содержащегоклавулановую кислоту (синергизм отмечается в участке пересечения зондиффузии двух дисков, расположенных на небольшом расстоянии друг от друга).Постановка теста1. Агар Mueller-Hinton II готовили в соответствии с инструкциями производителя.Автоклавирование производили при 1 атмосфере (температуре 121° С) втечение 15 минут.

После автоклавирования агар, тщательно перемешивая,охлаждали до 45-50° С на водяной бане. Приготовленный агар разливали встерильные чашки Петри на ровном, строго горизонтальном столе. Расходагара на чашку Петри диаметром 90 мм составлял 20 мл; толщина агара приэтом находилась в пределах рекомендуемых величин (4±0,5 мм). Послезастывания агара при комнатной температуре, чашки подсушивали втермостате при температуре +35° С в течение 15-20 минут для удаленияконденсата.2. Послевыделениячистойкультуры,дляприготовленияинокулюмаиспользовали суточную агаровую культуру исследуемых микробов. С суточнойкультуры брали 4-5 репрезентативных колоний одного типа и вносили впробирку с 3-5 мл 0,9% изотонического раствора хлорида натрия додостижения плотности инокулюма 0,5 по стандарту мутности McFarlandStandard, производства BioMerieux (Франция).

Данная плотность инокулюмасоответствует бактериальной концентрации 1,5х108/мл, и является стандартомопределения чувствительности для данной группы микробов. Приготовленный19инокулюм оценивали с помощью денситометра («DENSIMAT», BioMerieux(Франция).3. Инокуляцию проводили с помощью стерильных ватных тампонов в течение 15минут после приготовления инокулюма. Тампон смачивали в бактериальнойсуспензии и, слегка отжав о стенки пробирки, наносили культуру в трёхразличных направлениях для получения равномерного роста микробов. Переднанесением дисков с антибактериальными препаратами, чашки оставляли нарабочем столе на 15-20 минут для абсорбции инокулюма.4. Для подтверждения БЛРС-фенотипа на поверхность агара накладывались дискис антибактериальными препаратами в следующем порядке: в центре — диск,содержащий клавулановую кислоту (аммоксициилин/клавуланат 20/10 мкг), побокам от него на расстоянии 20 и 30 мм между центрами дисков — диски сцефтазидимом (30 мкг) и цефотаксимом (30 мкг).

Использование двух дисковкаждого антибактериального препарата, расположенных на разном расстоянииот диска с клавулановой кислотой, позволяет повысить эффективностьобнаружения БЛРС.5. Для выявления штаммов P. aeruginosa, подозрительных на продукцию МБЛ,накладывались диски с антибактериальными препаратами в следующемпорядке: в центре — диск, содержащий этилендиаминтетрауксусную кислоту(ЭДТА) (5 мкл 500 мМоль раствора [pH 8.0]), по бокам от него на расстоянии20 и 30 мм между центрами дисков — диски с имипенемом (10 мкг) имеропенемом (10 мкг) (Becton Dickinson, США).6. При каждой постановке фенотипического скрининга продуцентов карбапенемази БЛРС параллельно проводилось тестирование контрольных штаммов P.aeruginosa ATCC 27853, P.

aeruginosa ATCC 20685 к имипенему, меропенемуи ЭДТА, E. coli ATCC 25922 и E. coli ATCC 35218 к цефтазидиму ицефотаксиму и аммоксициллин/клавуланату, рекомендованного стандартамиNCCLS.207. Если тестируемые бактерии вырабатывают БЛРС (действие, которых вбольшинстве случаев обратимо клавуланатом), зона подавления роста вокругдиска с цефалоспорином III поколения окажется «вытянутой» в сторону дискас амоксициллином/клавуланатом. Причиной данного эффекта являетсядополнительное подавление роста микроба в той зоне, куда диффундирует иклавуланат, и цефалоспорин.8.

Аналогична интерпретация теста при выявлении штаммов P. aeruginosa,подозрительных на продукцию МБЛ. Данный фенотипический метод основанна способности ряда соединений ингибировать активность МБЛ за счётсвязывания иона цинка, «сериновые»-лактамазы при этом не ингибируются.К наиболее распространенным ингибиторам относится ЭДТА. В ходеисследования оценивались зоны ингибиции. Если между дисками скарбапенемными антибиотиками и диском с ингибитором происходилоувеличениезоныингибициироста(илиеёпоявление),тоштаммрассматривался как вероятный продуцент МБЛ (рисунки 2, 3, 4, 5).Рисунок 2. Положительный результат скрининга P. aeruginosa на продукциюМБЛ.