Автореферат (Иммунные и метаболические нарушения у больных с хронической ишемией мозга; способы фармакологической дифференцированной коррекции), страница 4

и др., 2016).Оценка клинико-лабораторных данных и неврологического статуса в основной группепредпринята в начале и через 2 недели после лечения. Оценка когнитивной дисфункции прово-13дилась через 2 месяца после комплексного лечения (в основной группе). Лечение соответствовало принципам доказательной медицины.Все пациенты основных групп во время нахождения в стационаре в течение 14 днейежедневно получали базовую фармакологическую терапию: ингибитор ангиотензинпревращающего фермента – эналаприла малеат (берлиприл) (поддерживающая гипотензивная терапия) ивазоактивный препарат – винпоцетин (кавинтон).Дизайн исследования, фармакологические препараты и схемы их назначения пациентамосновных групп представлены в таблице 1.Все препараты вводили согласно рекомендациям, изложенным в Федеральном руководстве по использованию лекарственных средств (формулярная система) под редакцией А.Г. Чучалина, В.В.

Яснецова (Москва, 2014-2016) и в национальном руководстве «Неврология» подредакцией Е.И. Гусева, А.Н. Коновалова, А.Б. Гехта (Москва, 2016).1Лабораторные исследования. Оценку клинико-лабораторных данных в основныхгруппах осуществляли в начале лечения и через 2 недели после его окончания. Из 10 мл гепаринизированной крови путем центрифугирования получали плазму и эритроцитарную массу,которую отстаивали в 20 мл 10 мМ Na-фосфатного буфера (рН=7,4), содержащего 0,9% хлориданатрия и 3% декстрана Т-500, в течение 30 минут при температуре 37ºС. Надосадочную жидкость после центрифугирования удаляли, а эритроциты подвергали очистке через НВSцеллюлозу и сразу определяли сорбционную способность эритроцитов (Тогайбаева А.А. и др.,1988) и сорбционную емкость гликокаликса (Семко Г.А., 1998).Интенсивность процессов перекисного окисления липидов оценивали по содержанию вплазме крови и эритроцитах ацилгидроперекисей и малонового диальдегида, образующих с тиобарбитуровой кислотой окрашенный комплекс, экстрагируемый бутанолом.

ОпределениеМДА и АГП проводили с помощью набора «ТБК-Агат» («Агат-Мед» Россия), при использовании спектрофотометра «Апель-330» (Япония) при длине волны 535 нм и 570 нм.Состояние антиоксидантной системы определяли методом прямого/конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа с детекцией продуктов реакции в диапазоне длиныволны 405-630 с применением готовых коммерческих наборов: активность супероксиддисмутазы «Bender Medsystems» (Австрия) и каталазы «Cayman Chemical» (США). Общую антиокислительную активность выявляли методом, основанным на степени ингибирования аскорбат- иферроиндуцированного окисления твина-80 до МДА. Уровень стабильных метаболитов оксидаазота выявляли при длине волны 540 нм с применением набора для твердофазного иммуноферментного анализа фирмы «R&D» (Англия)._____________________141Определение иммунологических и биохимических показателей проведено в НИИ экспериментальной медицины Курского государственного медицинского университета и клинической лабораторией МУЗ ГКБ № 4 г.

Курска, за что выражаем сотрудникам соответствующих подразделений глубокую признательность.Кроме этого, в плазме крови определяли иммуноферментным анализом уровень неоптерина «IBL» (Германия), эндотелина-1 «Biomedica» (Словакия) и эритропоэтина «Biomerica»(США).

Церулоплазмин определяли методом иммунотурбидиметрии с помощью набора «Сентинель» (Испания), а С-реактивный белок тем же методом набором «Вектор-Бест» (Россия) наполуавтоматическом анализаторе «BTS-350» (BioSystems, Испания).Таблица 1 – Распределение больных по способу проводимой фармакотерапииБольные№группыФармакотерапияКоличествоЭналаприл (берлиприл), Berlin-Chemie AG/Menarini Group (Германия), Берлиприл® плюс, Берлин-Фарма ЗАО, Россия, 10 мг в суткивнутрь, через 24 часа, № 14104Кавинтон (винпоцетин), Gedeon Richter (Венгрия), 10 мг в 200,0 мл0,9% раствора хлорида натрия внутривенно, капельно, через 24 часа, № 14Альфосцерат холина (церетон), ЗАО «ФармФирма Сотекс», РФ,121000 мг внутривенно капельно в 200,0 мл 0,9% раствора хлориданатрия, через 24 часа, № 141Депротеинизированный гемодериват крови телят (актовегин), ЗАО«ФармФирма Сотекс», РФ, 200 мг в 5 мл, внутривенно, струйно,через 24 часа, № 14Цитиколин (цераксон), Ferrer Internacional S.A., Испания, 1000 мг12внутривенно, струйно, через 24 часа, № 142Этилметилгидроксипиридина сукцинат (мексикор), ООО «ЭкоФармИнвест», РФ, 200 мг, через 24 часа, внутривенно, струйно втечение 5 минут, № 14Цераксон, мексикор и глутамил-цистеил-глицин динатрия (глуток143сим), ЗАО «Фарма Вам», РФ, 30 мг в виде 3% раствора, 1 мл, внутримышечно, через 24 часа, № 14Цераксон и мексикор и азоксимера бромид (полиоксидоний), ООО144«НПО Петровакс Фарм», РФ, 6 мг (внутримышечно), 8 раз (первые2 дня через 24 часа, затем через 48 часов)1Церетон и актовегин122Цераксон и мексикор123Цераксон, мексикор и глутоксим144Цераксон и мексикор и полиоксидоний14Всего104Доноры22Цитокины (TNFα, IL-1β, IL-6, IL-8, IFNγ, IL-2, IL-17, IL-18, G-CSF, IL-4, IL-10, IL-1RA)ХИМ-IIХИМ-IБазоваяфармакотерапия(всем пациентам)выявляли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов ЗАО«Вектор-Бест» (Россия), компоненты системы комплемента (С3, С3а, С4, С5, С5а) и фактор Н –диагностическим набором ООО «Цитокин» (Россия).

Активность С1-ингибитора определяли15хромогенным методом по способности ингибировать С1-эстеразу. Регистрация всех результатовиммуноферментного анализа осуществлялась при помощи микропланшетного фотометра «Sunrise», Tecan (Австрия).Фагоцитарную активность полиморфноядерных лейкоцитов крови после их выделенияиз крови на градиенте плотности фиколл-урографин (d=1,077) оценивали, определяя фагоцитарный индекс, фагоцитарное число и индекс активности фагоцитоза (Медведев А.М., Чаленко В.В., 1991). Активность кислородзависимых систем нейтрофилов оценивали на спектрофотометре PD 303 SApel (Япония) по реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТтест), спонтанного и стимулированного зимозаном, индексу стимуляции и функциональномурезерву нейтрофилов (Зинкин В.Ю., 2004).Методом G.T. Dodge (1963) получали мембраны эритроцитов, электрофоретическое разделение мембранных белков проводили в присутствии додецилсульфата натриявверти-кальных пластинах полиакриламидного геля по методу U.K.

Laemli (1970). Для линейногоприготовления анализируемой пробы для электрофореза брали 50 мкл мембран эритроцитов.Электрофореграммы окрашивали красителем Кумасси R250 по модифицированной методике G.Fairbanks (1971). Денситометрирование одномерных электрофореграмм проводили на лазерномденситометре «Ultroscan XL». Идентификацию и расчет белковых фракций согласно классификации Стека-Фербенкса проводили с использованием программы OneDscan. Количественноесодержание белковых фракций рассчитывали через полученную площадь искомого белка, маркерного белка и известную массу маркерного белка человеческого сывороточного альбумина.Концентрацию белка во фракциях рассчитывали по установленной массе (мкг) и выражали вмикрограммах на 1 мкл общего белка мембраны, или мг%.Содержание липидов в мембране эритроцитов определяли методом жидкостной тонкослойной хроматографии (Крылов В.И.

и др., 1984). С целью проявления хроматограмм пластины обрабатывали 5% спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты с последующимнагреванием в термостате при 100°С в течение 5 мин до появления голубых пятен липидов.Идентификацию фракций липидов осуществляли с использованием стандартов компании«Sigma», США. Анализ полученных хроматограмм проводили денситометрическим методом спомощью программы OneDscan. Количество липидов (мг/дл) устанавливали по калибровочнымграфикам стандартных растворов.Статистическая обработка результатов. При статистической обработке результатовисследования для сравнения качественных параметров использовали критерий χ2 (хи-квадрат).Для оценки принадлежности количественных признаков к виду распределения использовалитест Шапиро-Уилка.

Для сравнения нормально распределенных величин использовался tкритерий Стьюдента. Оценку статистической значимости различий количественных величин с16ненормальным распределением осуществляли с помощью U-критерия Манна-Уитни и критерияВилкоксона (при сравнении зависимых групп). Значения нормально распределенных количественных параметров представлены средним арифметическим (M) с ошибкой средней арифметической (m), а ненормально распределенных – медианой (Ме) с межквартильным интервалом(Р25; Р75). Взаимосвязи устанавливали на основании факторного анализа, кластерного анализаи коэффициента ранговой корреляции Спирмена (Гублер Е.В., Генкин А.А., 1973; Лакин Г.Ф.,1980).

Статистически значимыми считали различия при p < 0,05.Степени расстройств и изменений лабораторных параметров под влиянием фармакологических препаратов рассчитывали по специальным формулам А.М. Земского и др.(2013, 2015, 2016).Эффективность неврологического статуса проводимого лечения оценивали в баллах. Воснове разработанной системы оценки лежат данные ретроспективного анализа 545 историйболезни пациентов с диагнозом ХИМ, находившихся на стационарном лечении с 2009 г. по2014 г. Для присвоения балла от одного до трех определенной совокупности симптомов былаиспользована методика последовательной диагностической процедуры, в основе которой лежитметод секвенциального анализа (Будяков С.В. и др., 2010; Воронина Е.Ю.

и др., 2014; Шульгинова А.А. и др., 2016).РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯИзменения иммунных и метаболических лабораторных параметров при хронической ишемии мозга I и II стадии на фоне гипертонической болезни. До начала лечения вплазме крови больных ХИМ с I стадией установлено повышение концентрации провоспалительных цитокинов: TNFα, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-17 и IL-18 соответственно в 4,4; 2,4; 5,5; 5,9; 1,2;и 2,6 раза, противовоспалительных цитокинов: IL-4, IL-10 и IL-1RA соответственно в 8,0; 1,4 и1,1 раза. Содержание IFNγ, IL-2 и ростового фактора G-CSF оказалось выше параметров здоровых доноров соответственно в 1,4; 45,0 и 1,7 раза (рисунок 1).При II стадии ХИМ в плазме крови выявлены в целом сходные по направленности изменения содержания цитокинов. Уровени TNFα, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-17 и IL-18 оказались повышенными соответственно в 5,2; 2,1; 5,8; 9,0; 2,6 и 2,8 раза. Содержание IL-4, IL-10 и IL-1RAувеличивалось соответственно в 20,0; 1,4 и 1,2 раза, а IFNγ, IL-2 и G-CSF в 1,5; 48,6 и 1,9 раза(рисунок 1).У больных с I и II стадией хронической ишемии мозга перед началом лечения в плазмекрови выявлено снижение содержания С3 и С5-компонентов комплемента, С1-ингибитора, повышение компонентов С3а и С5а, уровень С4 остался в пределах нормы.

Концентрация ингибитора – фактора Н при ХИМ I стадии не отличалась от значений доноров, а при II стадии оказалась снижена (рисунок 1).17TNFα300IFNγIL-1β250ИСН 140200IL-1RAIL-17150ФРННСТ-ст.50IL-180С4120100806040200100IL-6С3С5С3аНСТ-сп.IL-10IL-2С5аИАФФактор НФЧIL-4IL-8С1-инг.ФИG-CSFПримечания: 1.– показатели у здоровых доноров (1 группа);2.– показатели у больных ХИМ I стадии до лечения (2 группа);3.– показатели у больных ХИМ II стадии до лечения (3 группа);4.– р < 0,05 между показателями по отношению к 1 группе;5.– р < 0,05 между показателями 2 и 3 групп.Рисунок 1 – Иммунные нарушения при хронической ишемии мозгаI и II стадии на фоне гипертонической болезниНесколько различными при поступлении в клинику у больных ХИМ с I и II стадией оказались результаты исследования функционально-метаболической активности нейтрофилов периферической крови: отсутствие изменений по сравнению со здоровыми донорами показателейактивности и интенсивности фагоцитоза (ФИ, ФЧ и ИАФ), увеличение НСТ-сп.