Диссертация (Химико-токсикологический анализ гипотензивных лекарственных средств при острых отравлениях), страница 6

Изучены физико-химические, фармакологические и токсикологическиесвойства гипотензивных лекарственных средств. Установлено, что диапазон их токсических концентраций достаточно широк, что требуетразработки аналитических методик с большим линейным диапазоном.Установлено, что моча является наиболее удобным объектом для проведения скрининга, а данные о концентрации токсиканта в плазме позволяет судить о тяжести отравления и проводить контроль детоксикационной терапии.3. На основании опубликованных методик обнаружения гипотензивныхлекарственных средств установлено, что для скринингового и подтверждающего качественного анализа ГЛС наилучшим образом подходитметод ГХ-МС, однако при его использовании затруднено количественное определение ГЛС в пробе.

Для подготовки проб мочи к анализу методом ГХ-МС оптимальна жидкость-жидкостная экстракция.4. На основании описанных методик сделан вывод, что метод ВЭЖХМС/МС пригоден для подтверждающего химико-токсикологическогоанализа и количественного определения ГЛС в плазме крови. Установлено, что оптимальным способом пробоподготовки в этом случае является осаждение белков ацетонитрилом.40ГЛАВА 2. РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ СКРИНИНГАГИПОТЕНЗИВНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ПРИ ОСТРЫХОТРАВЛЕНИЯХ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ2.1. Материалы и методы2.1.1.

ОборудованиеДля анализа методом тонкослойной хроматографии, приготовлениярастворов, пробоподготовки образцов мочи и детектирования анализируемыхвеществ было использовано следующее оборудование: пластины для ТСХ POLYGRAM® на гибкой полиэфирной подложкес закрепленным силикагеля SIL G/UV254 толщиной 0,25 мм(Macherey–Nagel, Германия); УФ-кабинет CХ-20 (Spectroline, США); Весы лабораторные Shimadzu AUW 120D (Shimadzu, Япония); Вортекс-шейкер V-3 SkyLine (Elmi, Латвия); Лабораторная центрифуга CM 6M (Elmi, Латвия); Лабораторный шейкер S-3 (Elmi, Латвия); Система концентрирования экстрактов Omega-12 с электрическойплиткой и одноразовыми алюминиевыми виалами для упаривания (всоставе системы TOXI LAB, Varian, США); Дозатор переменного объёма Eppendorf Research® plus 100-1000 мкл(Eppendorf, Германия); Дозатор переменного объёма Eppendorf Research® plus 10-100 мкл(Eppendorf, Германия).2.1.2.

Растворы и реактивыДля приготовления подвижных фаз, стандартных растворов, детектирующих растворов, при пробоподготовке были использованы следующие реактивы: толуол (чда, Реахим, Россия)41 изопропанол (чда, Реахим, Россия) хлороформ (extra pure, Scharlau, Испания) этанол 96% (Медхимпром, Россия) этилацетат (extra pure, Scharlau, Испания) ацетон (extra pure, Scharlau, Испания) концентрированный раствор аммиака 32% (extra pure, Scharlau, Испания) ледяная уксусная кислота (extra pure, Scharlau, Испания) висмута нитрат основной (extra pure, Scharlau, Испания) калия йодид (чда, Acros organics, Бельгия) натрия нитрит (чда, Acros organics, Бельгия) азотная кислота (extra pure, Scharlau, Испания) серная кислота (extra pure, Scharlau, Испания) вода очищенная образцы мочи человека, не содержащие анализируемых веществ(интактная, холостая, или «бланковая» моча)2.1.3.

Стандартные образцы Атенолол (≥98%, SIGMA, годен до 10.2015) Верапамила гидрохлорид (≥99%, SIGMA, годен до 03.2016) Нифедипин (≥98%, SIGMA, годен до 05.2016) Пропранолола гидрохлорид (вторичный стандарт, соответствуетUSP, SIGMA-ALDRICH, годен до 08.2017) Эналаприла малеат (вторичный стандарт, соответствует USP,SIGMA-ALDRICH, годен до 11.2015)2.1.4. Приготовление растворов и пробоподготовкаДля приготовления исходного стандартного раствора в мерную колбувместимостью 20 мл помещали 10,0 мг ГЛС (в пересчёте на основание и сучётом чистоты стандартного образца), прибавляли 10 мл этанола, переме-42шивали до полного растворения, доводили объём раствора до метки тем жерастворителем и снова перемешивали. Массы навесок ГЛС и концентрацииполученных стандартных растворов представлены в таблице 8.Таблица 8.Массы навесок и концентрации стандартных растворов ГЛСГЛСНавеска,Концентрация в исходном стандартном рас-мгтворе, мкг/мл (в форме основания)Атенолол10,20Верапамила10,87гидрохлоридНифедипин10,20Пропранолола11,63500,00гидрохлоридЭналаприла13,33малеатДля приготовления модельных проб к 10 мл бланковой мочи добавляли100 мкл стандартного раствора ГЛС.

Концентрация ГЛС в полученном растворе составляла 5 мкг/мл.Пробоподготовка образцов мочи проводилась методом ЖЖЭ с использованием готовых стандартных экстракционных систем Toxi Tube А (AgilentTechnologies) для веществ нейтрального и слабоосновного характера (атенолол, верапамил, нифедипин, пропранолол) и Toxi Tube B (AgilentTechnologies) для веществ слабокислого и нейтрального характера (эналаприл). Toxi Tube А содержит в качестве экстрагента 2,3 мл смеси гептан –изопропанол – 1,2-дихлорэтан – дихлорметан (77 : 38 : 58 : 58), натрия хлорид как высаливающий агент и смесь карбоната и гидрокарбоната натрия вкачестве буфера.

Toxi Tube B содержит в качестве экстрагента 2.3 мл смесигептан – дихлорметан (105 : 125), цинка хлорид как высаливающий и создающий кислую реакцию среды агент.43В пробирки Toxi Tube помещали 3 мл мочи, экстракцию проводили нашейкере с частотой 100 об. мин–1 в течение 3 минут. Слои жидкостей разделяли центрифугированием в течение 5 минут со скоростью 3200 об. мин –1.Отбирали органическую фазу (верхний слой), упаривали досуха. Сухой остаток перерастворяли в 200 мкл этилацетата.Реактив Драгендорфа готовили по методике Государственной Фармакопеи XIII [41]. Для приготовления раствора 1 к 0,85 г висмута нитрата основного прибавляли 40 мл воды, 10 мл уксусной кислоты и взбалтывали в течение 15 мин. Для раствора II 8 г калия йодида растворяли в 20 мл воды.Смешивали равные объемы растворов I и II. К 10 мл полученной смеси прибавляли 100 мл воды и 20 мл уксусной кислоты концентрированной.Реактив Либермана готовили, растворяя 2 г натрия нитрита в 20 млсерной кислоты при охлаждении и тщательном перемешивании [104].2.1.5.

Разработка хроматографической методикиВыбор подвижной фазы проводили с учётом кислотно-основныхсвойств исследуемых соединений. Хроматографическое разделение проводилось в прямофазном режиме, то есть неподвижная фаза имела большую полярность чем элюент. Для улучшения сродства слабых оснований к подвижной фазе добавляли аммиак, а для слабых кислот – уксусную кислоту.Для веществ нейтрального и основного характера (атенолол, пропранолол, верапамил, нифедипин) были выбраны следующие подвижные фазы: толуол - изопропанол - конц. раствор аммиака (5:4:1), хлороформ - этанол (9:1),этилацетат - этанол - конц. раствор аммиака (10:30:1). Для эналаприла каквещества слабокислого характера были выбраны следующие подвижные фазы: ацетон - ледяная уксусная кислота (20:1), хлороформ - ацетон - ледянаяуксусная кислота (10:2:2).Перед проведением анализа хроматографическая камера насыщаласьпарами подвижной фазы в течение 30 минут.

На линию старта пластинкидлиной 10 см наносили по 5 мкл. стандартных растворов лекарственных веществ в концентрации 500 мкг/мл. Пластинки помещались в хроматографи-44ческую камеру, и проводилось разделение методом восходящего хроматографирования. Когда фронт подвижной фазы проходил 90% длины, пластинывынимали и высушивали на воздухе.Детектирование веществ проводили, просматривая пластины в УФсвете при 254 нм. Далее пластины обрабатывали либо модифицированнымреактивом Драгендорфа, либо реактивом Либермана, либо смесью концентрированных серной и азотной кислот (1:1 по объёму).2.2.

Результаты и обсуждениеЗначения коэффициентов подвижности (Rf) для ГЛС в различных системах растворителей, установленные в ходе эксперимента с использованиемТСХ, приведены в таблице 9.Таблица 9.Rf исследуемых гипотензивных веществ в различных системах растворителей.Подвижная фазаАтено-Пропра-Верапа-Нифе-Энала-лолнололмилдипинприл0,5111-0,230,510,83-0,430,610,94-----0,79ледяная уксусная кисло- ----0,54толуол - изопропанол конц.

раствор аммиака 0,30(5:4:1)хлороформ - этанол (9:1) 0,02этилацетат - этанол конц. раствор аммиака 0,27(10:30:1)ацетон - ледяная уксусная кислота (20:1)хлороформ - ацетон та (10:2:2)45Среди опробованных подвижных фаз наиболее полного разделениявеществ удаётся добиться в системе хлороформ - этанол (9:1). Однако, этасистема не подходит для элюирования эналаприла. Атенолол имеет слабуюподвижность при данном составе подвижной фазы, так как является полярным соединением, и практически не растворяется в смеси хлороформа и этанола.

В системе этилацетат - этанол - конц. раствор аммиака (10:30:1) такженаблюдается хорошее разделение исследуемых веществ, однако нифедипинпрактически не сорбируется неподвижной фазой в данных условиях и элюируется с фронтом растворителя. В системе толуол - изопропанол - конц. раствор аммиака (5:4:1) не удаётся разделить верапамил и нифедипин, поэтомуона не пригодна для скрининга ГЛС при острых отравлениях.Как в случае сильного удерживания компонента силикагелем (Rf < 0,1),так и в случае элюирования вещества с фронтом подвижной фазы (Rf > 0,9)создаются трудности для детектирования пятен и интерпретации результатов, т.к.

исследуемы вещества будут накладываться на другие сильно илислабо удерживаемые компоненты, соответственно.Эналаприл, как слабая кислота, имел оптимальное удерживание в системе хлороформ - ацетон - ледяная уксусная кислота (10:2:2), которая непригодна для анализа соединений основного характера.При рассмотрении пластин в УФ-свете пятна всех исследуемых веществ выглядят как зоны гашения флуоресценции. В таблице 10 указаны результаты проведения цветных реакций исследуемых лекарственных веществс проявляющими реактивами.46Таблица 10.Окрашивание пятен гипотензтвных лекарственных веществ с различнымипроявляющими реактивами.РеактивВеществоАтенололРеактив Дра-РеактивгендорфаЛиберманаОранжевыйH2SO4 – HNO3 (1:1)Светло-Серо-коричневый,кирпичный,пе- слабыйреходящийвбесцветныйПропранололВерапамилОранжевыйСине-зелёный,Светло-оранжевый,переходящийв переходящий в жёл-зелёныйто-зелёныйЖёлто-Серо-Малиновый, перехо-оранжевыйкоричневый,дящийкирпично-коричневыйкраснаявсеро-каймапри нагреванииНифедипинЖёлтыйЖёлтый с корич- Ярко-жёлтыйневатой каймойЭналаприлЖёлто-Оранжевый, пе- Коричневато-жёлтыйоранжевыйреходящий в бурыйРеактив Драгендорфа селективен в отношении азотистых оснований.Все исследуемые вещества, кроме нифедипина, имеют основный атом азота,поэтому реактив Драгендорфа не специфичен по отношению ни к какому извеществ.