Диссертация (Химико-токсикологический анализ гипотензивных лекарственных средств при острых отравлениях), страница 8

Масс-спектр бисопролола.307.34 324.95300555942urA #678 RT: 12.39 AV: 1 SB: 2 12.37 , 12.49 NL: 8.58E6T: + c Full ms [41.00-650.00]72.11009080Relative Abundance7060504030201045.1 56.1107.173.2116.177.1 100.1121.1 149.1 159.1050100223.2191.1150252.3 267.2279.6 294.3222.5 224.2200250328.4300m/zРисунок 4. Масс-спектр метопролола.6584urA #873 RT: 15.10 AV: 1 SB: 33 14.60-14.83 , 15.19-15.39 NL: 1.02E8T: + c Full ms [41.00-650.00]72.091009080Relative Abundance706050403020222.16106.9910251.22116.15 149.18050100150200250266.29 325.48 355.21300350m/z429.24400450477.07 504.33500Рисунок 5.

Масс-спектр атенолола.567.48550627.5260065056Масс-спектры исходных β-адреноблокаторов демонстрируют значительное сходство. Во всех спектрах имеется интенсивный пик со значениемm/z 72, остальные пики специфичны для каждого из исследуемых веществ, ноимеют значительно меньшую интенсивность. Пики молекулярных ионов вспектрах не обнаруживаются. Вероятнее всего, что за счет наличия в структурах атенолола, бисопролола, метопролола и пропранолола фрагмента 1-(Nизопропиламино)-пропанола-2 (рисунок 6) наблюдается идентичный преимущественный путь фрагментации с образованием иона C4H10N+, имеющего массу 72 Да.

Остальные пики в масс-спектрах исходных β-адреноблокаторов, обусловленные иными процессами фрагментации и индивидуальны для 4 исследуемых веществ ввиду наличия в структурах разных заместителей.CH3HONHCH3ORРисунок 6. Структура исследуемых β-адреноблокаторов в общем виде.В ходе исследования были выявлены некоторые особенности поведения ГЛС при анализе методом ГХ-МС. На хроматограммах растворов βадреноблокаторов помимо пиков ДФА и лекарственного вещества всегдаприсутствовал третий пик, имевший время удерживание на 0,5-1 мин большецелевого соединения.

По масс-спектрометрическим базам данных было установлено, что это пики соответствуют так называемым формилированным артефактам β-адреноблокаторов.Для установления структуры артефактов проведён анализ массспектров формилированных производных β-адреноблокаторов (рисунки 710).57anapriline10_dfa10_9sept #781 RT: 13.83 AV: 1 SB: 2 13.80 , 13.88 NL: 1.56E5T: + c Full ms [41.00-650.00]127.11009080Relative Abundance7060112.15040128.286.1271.330256.32056.257.185.271.41098.2144.1183.2155.3179.3195.3272.3255.5221.2 242.4303.3325.1341.3050100150200m/z250300Рисунок 7. Масс-спектр формилированного артефакта пропранолола.bisopr10_spirt #599 RT: 12.80 AV: 1 SB: 2 12.75 , 12.88 NL: 1.62E5T: + c Full ms [41.00-650.00]127.281009080Relative Abundance70322.33112.14128.20605043.1230337.36109.624056.182086.1685.15 107.1384.1473.1598.26234.28147.1910149.24308.35206.66190.19281.19207.21253.15338.44282.22355.30050100150200m/z250300350Рисунок 8.

Масс-спектр формилированного артефакта бисопролола.585942urA_hyp2 #410 RT: 10.18 AV: 1 SB: 2 10.09 , 10.25 NL: 6.38E6T: + c Full ms [41.00-650.00]264.2110090127.1580Relative Abundance70114.146050279.2956.1140128.2086.133085.1584.1470.1120159.12107.1098.15250.25133.19147.1810191.18161.17204.22280.33248.28281.30 309.86050100150200m/z250341.29 356.27300350Рисунок 9. Масс-спектр формилированного артефакта метопролола.2446_dfa200 #529 RT: 11.57 AV: 1 SB: 26 11.29-11.47 , 11.68-11.90 NL: 4.21E5T: + c Full ms [41.00-650.00]263.2100127.19080Relative Abundance7056.160112.15040128.230278.2145.170.1 84.1190.120249.210147.1279.3191.2296.2 338.7 360.4 386.8 416.8 463.0 504.9 546.1 562.9 597.4050100150200250300350m/z400450500550600643.9650Рисунок 10. Масс-спектр формилированного артефакта атенолола.59При анализе масс-спектров артефактов β-адреноблокаторов выявленосходство их спектров в интервале 44–130 m/z, что может свидетельствовать оподобии структур артефактов и едином механизме их образования.

Во всехспектрах обнаруживается пик молекулярного иона и пик со значением отношения массы к заряду М–15. Установлено, что молекулярная масса артефакта отличается от молекулярной массы соответствующего β-адреноблокаторана 12 Да, что, вероятнее всего, говорит о появлении в структуре одного дополнительного атома углерода. Предположительно, в инжекторе хроматографа при высокой температуре происходит термодеструкция молекул метанола с образованием формальдегида.

Последний вступает с молекулой βадреноблокатора в реакцию N-формилирования с последующей дегидратацией и циклизацией. В итоге образуются артефакты, являющиеся производными 1,3-оксазолидина (схема 7).Схема 7.Образование формилированных артефактов β-адреноблокаторов.CH3OH HOHONHOCH3H 2Ct°CH3ORONNCH3RH 3C-Н 2ОCH3OORПодобный механизм описан в некоторых источниках [57]. Однако вупомянутых работах в качестве растворителя используется метанол, а образование формальдегида объясняется его термическим дегидрированием.Артефакты, полученные в ходе исследования идентичны соединениям,описанным в литературных источниках, несмотря на то, что в эксперименте вкачестве растворителя использовался этилацетат.

Предполагается, что формальдегид образуется при термодеструкции метанола, который использовался как растворитель для дифениламина (внутренний стандарт), что и объясняет последующее образование формилированных артефактов.Данный механизм подтвержден путем проведения реакции между βадреноблокаторами и формальдегидом. Анализ продуктов модельной реак-60ции образования артефактов методом ГХ/МС подтверждает их наличие впробе и показывает полное отсутствие на хроматограмме пиков, соответствующих исходной форме β-адреноблокаторов. Тем самым подтверждено, чтоартефекты появляются в процессе формилирования и образования цикла 1,3оксазолидина.

Именно этот элемент химической структуры артефактов объясняет наличие в масс-спектре базового пика 127 m/z в ходе потери нейтрального фрагмента R-OH (схема8).Схема 8.Два важнейших направления фрагментации артефактовβ-адреноблокаторов.Пик 128 m/z имеет большую интенсивность, чем, если бы его появление в масс-спектре было обусловлено только вкладом изотопов 13C, 2H, 15N,17O. Данное явление можно объяснить фрагментацией артефактов по альтернативному пути с выделением радикала R-O*.Вцеломможнозаключить,чтомасс-спектрыартефактов β-адреноблокаторов более информативны в сравнении со спектрами соответствующих исходных соединений. Также артефакты образуют более высокие,узкие и симметричные пики.

Это позволяет с высокой достоверностью идентифицировать данные соединения по временам удерживания и достоверноподтверждать их путем сравнения с библиотечными масс-спектрами. В случае же исходных β-адреноблокаторов пики на хроматограмме не всегда достаточно интенсивны и имеют неправильную форму. При низких концентрациях возможна ошибка идентификации по масс-спектрам исходных веществ61ввиду значительного их сходства у разных β-адреноблокаторов.

Однако характерные масс-спектры артефактов позволяют избежать ошибки при идентификации.При анализе нифедипина на хроматограммах растворов стандартныхобразцов, как и в случае β-адреноблокаторов, наблюдалось два пика. Второйпо времени выхода на хроматограмме пик соответствовал исходному нифедипину, а первый - дегидронифедипину. Известно, что нифедипин очень легко окисляется (дегидрируется) как in vitro, так и in vivo. Можно предположить, что при вводе пробы в хроматограф в инжекторе также наблюдаетсяокисление, что и обуславливает появление двух пиков на хроматограммахрастворов стандартов (схема 9).Схема 9.Образование дегидронифедипина (2) из нифедипина (1) при дегидрировании.Дегидронифедипин одновременно является метаболитом нифедипина ворганизме человека.

Оба соединения с высокой достоверностью определяются по временам удерживания и масс-спектрам, однако при анализе биологических жидкостей большее внимание стоит обратить именно на дегидронифедипин, так как исходный нифедипин после окисления в организме и затемв инжекторе хроматографа будет обнаруживаться в незначительных количествах или даже окажется не различим на хроматограмме по полному ионному току, но его пик обнаруживается при отображении хроматограммы в режиме по выбранной массе – 329 m/z.62mixture_2mkl_hyp2 #726 RT: 14.56 AV: 1 NL: 4.51E6T: + c Full ms [41.00-650.00]329.281009080284.24Relative Abundance706050224.2240268.2330330.3120285.271042.1277.14152.16 167.20 192.21105.06 127.11346.27225.25 253.21207.12236.22328.30298.21347.31050100150200m/z250300350Рисунок 11.

Масс-спектр нифедипина.mixture_2mkl_hyp2 #525 RT: 11.77 AV: 1 SB: 2 11.70 , 11.86 NL: 1.91E6T: + c Full ms [41.00-650.00]298.241009080Relative Abundance7060504030299.272010115.16 133.71 152.1659.08 77.15224.14 236.18 251.22 267.23296.53180.18313.26314.32 338.84050100150200m/z250300Рисунок 12. Масс-спектр дегидронифедипина.35063Для эналаприла также характерно изменение исходной структуры привоздействии высокой температуры в инжекторе хроматографа. В данномслучае на хроматограмме присутствует лишь один пик, и он соответствуетартефакту, образующемуся в ходе дегидратации-циклизации – эналаприладикетопиперазину (схема 10).Схема 10.Дегидратация-циклизация молекулы эналаприла при нагревании.Данный механизм образования артефакта подтверждается тем, что вмасс-спектре пик молекулярного иона имеет значение m/z 358,32, что на 18Да меньшее, чем молекулярная масса эналаприла – 376,45 (рисунок 13).mixture_2mkl_hyp2 #857 RT: 16.38 AV: 1 SB: 2 16.31 , 16.49 NL: 5.55E5T: + c Full ms [41.00-650.00]254.27100208.229091.1380Relative Abundance706070.145040117.17169.2530358.32160.3297.152069.16 90.34257.30126.21153.20207.16 209.20253.3910152.3171.16206.45234.29264.88050100150200285.33250359.41313.32357.30329.09360.61305.16300350m/zРисунок 13.

Масс-спектр эналаприла дикетопиперазина.64Примечательно, что Государственная Фармакопея XIII издания для определения родственных примесей в субстанции эналаприла малеата методомВЭЖХ предлагает нагревать навеску стандартного образца эналаприла малеата на электрической плитке, затем растворять остаток после охлаждения вацетонитриле и использовать в качестве раствора для проверки пригодностихроматографической системы.

Указывается, что в ходе нагревания образуется эналаприла дикетопиперазин, который обнаруживается и в нашем исследовании как артефакт (схема 10).Единственным исследуемым веществом, которое не демонстрирует никакого специфического поведения при анализе методом ГХ-МС, являлся верапамил.mixture_2mkl_hyp2 #1470 RT: 24.89 AV: 1 SB: 2 24.71 , 25.09 NL: 5.83E5T: + c Full ms [41.00-650.00]303.331009080Relative Abundance7060504030304.45201043.1371.1396.08 107.20050100206.59150.86260.36 281.21165.17 190.57150.01208.13 234.41150200m/z250305.50 331.25 355.26300350Рисунок 14. Масс-спектр верапамила.В таблице 13 указаны времена удерживания исследуемых гипотензивных веществ и их артефактов. По характеристическим ионам в режиме отображения по выбранной массе возможно обнаружение вещества в минимальных количествах, даже когда в режиме отображения по полному ионному то-65ку пик скрыт под фоном.