Диссертация (Химико-токсикологический анализ гипотензивных лекарственных средств при острых отравлениях), страница 10

Надосадочную жидкостьпереносили в виалы и помещали их в автосамплер хроматографа.774.1.5. Разработка хроматографической методики определенияатенолола,бисопролола,верапамила,метопролола,нифедипина,пропранолола и эналаприлаРазделение осуществляли на колонке ZORBAX Eclipse Plus C18, 4,6 x150 мм, 5 мкм (Agilent Technologies, США) при температуре 40°С. Подвижная фаза состояла из элюента А: 0,1% муравьиной кислоты 1 ммоль/л формиата аммония / деионизованная вода – и элюента В: 0,1% муравьиной кислоты 1 ммоль/л формиата аммония / метанол. Хроматографическое разделение проводили в градиентном режиме элюирования, описанном в таблице 18.Скорость потока подвижной фазы составляла 0,8 мл/мин. Объем вводимойпробы – 10 мкл.Таблица 18.Градиент состава подвижной фазыВремя анализа, минОбъёмная доля элюента В, %0,0 → 2,530 → 452,5 → 4,0454,0 → 7,045 → 507,0 → 8,5508,5 → 1250 → 9012 → 149014 → 1590 → 3015 → 2030При использовании в качестве элюента В ацетонитрила наблюдалосьуширение пика эналаприла и низкая чувствительность по нему, не происходило полного разделения пропранолола и эналаприла.

Данную проблемуудалось решить путём замены ацетонитрила на метанол и применения 0,1%муравьиной кислоты и 1 ммоль/л формиата аммония в качестве динамического модификатора подвижной фазы. В этих условиях рН подвижной фазы78лежит в слабокислой области, что способствует протонированию аминогруппв молекулах ГЛС и, следовательно, положительно сказывается на ионизацииэлектрораспылением.

Помимо этого, увеличивается удерживание веществ наколонке и достигается их лучшее разделение, чем в отсутствии динамического модификатора.Масс-спектрометрическое детектирование проводили при положительнойионизации в режиме мониторинга множественных реакций (Multiple reactionmonitoring, MRM+). Ионы-предшественники, фрагментные ионы и энергии соударений для каждого вещества были подобраны экспериментально и представлены в таблице 19.Таблица 19Параметры масс-спектрометрического детектирования ГЛС в режиме MRM+.ВеществоАтенололМетопрололБисопрололИон-предшественник, Фрагментный ион,m/z267,20268,20326,30Энергия со-m/zударений, V164,00-30,00145,10-35,00133,10-35,00117,10-35,00159,10-30,00133,10-35,00121,10-35,00116,10-37,00162,10-23,00147,10-24,00133,10-25,00116,20-28,0079ПропранололЭналаприлВерапамилНифедипин260,20377,20455,40347,20183,10-24,00155,10-26,00129,10-27,00116,10-27,00303,10-23,00234,20-25,00160,10-24,00130,10-27,00117,20-50,00303,20-33,00260,10-33,00165,10-35,00150,10-35,00254,00-28,00239,10-30,00223,10-30,00195,10-35,00181,00-50,004.1.6.

Разработка хроматографической методики определенияэналаприла и эналаприлатаРазделение осуществляли на колонке Synergi Polar RP, 4 мкм, 250*4.6 мм(Phenomenex, США) с привитой фенильной неподвижной фазой при температуре 40°С. Подвижная фаза состояла из элюента А: 1% муравьиной кислоты /деионизованная вода – и элюента В: 1% муравьиной кислоты / ацетонитрил.Хроматографическое разделение проводили в градиентном режиме элюирования, описанном в таблице 20. Скорость потока подвижной фазы составляла 1мл/мин. Объем вводимой пробы – 10 мкл.80Таблица 20.Градиент состава подвижной фазыВремя анализа, мин Объёмная доля элюента В, %0,0 → 7,030 → 507,0 → 8,5508,5 → 12,550 → 10012,5 → 14,510014,5 → 15,5100 → 3015,5 → 20,030Введение в подвижную фазу различных добавок, называемых динамическими модификаторами, необходимо для изменения, а именно, улучшения хроматографического разделения. Произведен экспериментальный подбор динамического модификатора для обеспечения оптимального разделения и ионизации эналаприла и эналаприлата при совместном присутствии.

Наилучшие результаты достигнуты при добавлении к подвижной фазе муравьиной кислоты вколичестве 1% по объёму. При этом при отсутствии модификаторов не наблюдалось полного разделения исследуемых веществ. Соли муравьиной кислоты,как и она сама, являются летучими, кроме того, добавка кислот в случае ионизации электрораспылением важна для формирования правильной формы каплиполучаемого аэрозоля и как следствие улучшение ионизации веществ.Эналаприл содержит в своей структуре карбоксильную и вторичнуюалифатическую аминогруппу, а в молекуле эналаприлата имеются две карбоксильных и вторичная алифатическая аминогруппа.

В связи с этим оба соединения обладают как кислотными, так и основными свойствами, в зависимости отрН в растворе эти вещества могут существовать в форме катионов, анионов ицвиттер-ионов. Для улучшения ионизации электрораспылением в положительном режиме и, следовательно, увеличения чувствительности методики необходимо подавление диссоциации карбоксильных групп эналаприла и эналаприлата и смещение кислотно-основного равновесия в сторону протонирования ами-81ногруппы для приобретения молекулой положительного заряда, что достигается при взаимодействии исследуемых соединений с муравьиной кислотой.Более ярко выраженные кислотные свойства эналаприлата приводят ктому, что эффективность его ионизации и сигнал детектора примерно в 10 разменьше по сравнению с эналаприлом. Тем не менее, предложенные условияанализа обеспечивают нПКО методики на уровне 5 нг/мл и оставляют возможность ещё больше его снизить.В процессе создания методики был произведен подбор неподвижной фазы.

Колонка Synergi Polar RP с силикагелем, модифицированным фенильнымирадикалами, позволила достичь более качественного разделения, чем колонкаZorbax Eclipse XDB-C18 с силикагелем, модифицированным алкильным радикалами С18. Разрешение между пиками эналаприла и эналаприлата и удерживание эналаприлата увеличилось, уменьшилось размывание пиков. Данное явление можно объяснить тем, что фенильная неподвижная фаза по сравнению сфазой С18 и лучше сорбирует эналаприл и эналаприлат за счёт ππвзаимодействий. Существенно, что колонка Synergi Polar RP способна работатьпри рН 1,5, позволяя тем самым увеличить концентрацию муравьиной кислотыв подвижной фазе до 1% и подавить диссоциацию молекул эналаприла и эналаприлата по карбоксильным группам.При определении условий масс-спектрометрического детектирования врежиме сканирования полного ионного тока (scan+) были выбраны ионыпредшественники: для эналаприла 349,30 m/z, для эналаприлата 377,20 m/z, чтосоответствует протонированным молекулярным ионам исследуемых веществ.Затем в режиме сканирования фрагментных ионов (product scan+) были выбраны ионы, которые в дальнейшем использовались для мониторинга множественных реакций (MRM+).

Энергия соударений подбиралась экспериментально. Втаблице № 21 представлены параметры детектирования в режиме MRM+.82Таблица 21.Параметры детектирования эналаприла и эналаприлата в режиме MRM+.№ п/пИон предшественник,ФрагментныйЭнергияm/zион, m/zсоударений, ВЭналаприлат1206,10-30,0160,10-35,0134,10-30,0117,10-35,01303,10-23,02234,20-25,0160,10-24,04130,10-27,05117,20-50,023349,304Эналаприл3377,204.2. Результаты и обсуждение4.2.1. Валидация методики определения атенолола, бисопролола,верапамила, метопролола, нифедипина, пропранолола и эналаприлаВалидация методики количественного определение атенолола, бисопролола, верапамила, метопролола, нифедипина, пропранолола и эналаприла вплазме крови человека методом ВЭЖХ-МС/МС выполнена по следующим характеристикам: селективность, линейность, правильность (внутри цикла и между циклами), прецизионность (внутри цикла и между циклами), предел количественного определения, перенос пробы, стабильность растворов, эффект матрицы, извлечение [105, 106, 107].Селективность методики оценивали при сравнении хроматограмм пробинтактной плазмы с прибавлением стандартных растворов атенолола, бисопролола, верапамила, метопролола, нифедипина, пропранолола и эналаприла (ри-83сунок 20) с хроматограммами проб интактной плазмы (рисунок 21).

На хроматограмме пробы интактной плазмы не наблюдается пиков, соответствующих повременам удерживанию ГЛС. Времена удерживания имеют следующие величины: атенолол – 1,93 мин, метопролол – 4,28 мин, бисопролол – 6,46 мин, пропранолол – 7,43 мин, эналаприл – 8,34 мин, верапамил – 9,99 мин, нифедипин –12,39 мин.Рисунок 20. Хроматограмма образца интактной плазмы с добавлением смесиГЛС на уровне нПКО.Рисунок 21. Хроматограмма образца интактной плазмы.84При оценке линейности проводили анализ 7 проб интактной плазмы с добавлением стандартного раствора атенолола, бисопролола, метопролола, нифедипина, пропранолола и эналаприла до получения концентраций на уровне 10,50, 100, 500, 1000, 2500, 5000 нг/мл и. 6 проб интактной плазмы с добавлениемстандартного раствора верапамила до получения концентраций на уровне 10,50, 100, 500, 1000, 2500 нг/мл.Для атенолола, бисопролола, верапамила, метопролола, пропранолола иэналаприла построены калибровочные графики с использованием весового коэффициента 1/С (Рис.