Диссертация (Химико-токсикологический анализ гипотензивных лекарственных средств при острых отравлениях), страница 9

Также на основе полученных данных была созданабиблиотека для автоматической обработки хроматограмм с использованиемпрограммного обеспечения AMDIS 2.66.Таблица 13.Времена удерживания (tR) и относительные времена удерживания (RRT) гипотензивных лекарственных веществ и их артефактов.ВеществоtR, минRRTДифениламин (внутренний стандарт)6,031Метопролол9,451,57Метопролол, формил. артефакт10,161,68Пропранолол10,651,77Пропранолол, формил. артефакт11,371,88Дегидронифедипин11,761,95Бисопролол12,072,00Бисопролол, формил. артефакт12,772,12Атенолол13,922,31Атенолол, формил.

артефакт14,202,35Нифедипин14,562,41Эналаприла дикетопиперазин16,372,71Далее были приблизительно оценены пределы обнаружения (ПО) ГЛСв моче с помощью разработанной методики. Для этого были использованымодельные смеси мочи, свободной от анализируемого вещества, с ГЛС вконцентрациях 30, 50, 100, 500, 1000, 5000 нг/мл и проведена пробоподготовка по описанной процедуре. В качестве ПО приняты минимальные концентрации ГЛС, при которых соотношение сигнал – шум для пика ГЛС на хроматограмме составляло 3 : 1. Были получены следующие значения ПО: пропранолол – 100 нг/мл, атенолол –500 нг/мл, бисопролол – 100 нг/мл, метопролол – 100 нг/мл, нифедипин – 30 нг/мл, эналаприл – 50 нг/мл.

Получен-66ные данные демонстрируют, что чувствительности метода теоретически достаточно для определения ГЛС в токсических концентрациях как в моче, так ив плазме крови. Однако, учитывая, что зачастую больные поступают спустязначительное время после приёма лекарственного средства, ставшего причиной отравления, концентрация ЛС в плазме может быть значительно нижетоксических значений за счёт метаболизма и выведения лекарственного вещества. При этом концентрация исходного вещества и метаболитов в мочебудет выше, чем в плазме, оставаясь выше предела обнаружения по даннойметодике. Можно заключить, что разработанная процедура скрининга ГЛСметодом ГХ/МС без дериватизации даёт достоверные результаты при анализепроб мочи, но её использование нецелесообразно для обнаружения ГЛС вплазме из-за риска ложноотрицательных результатов.Попытка построения калибровочных графиков для количественногоопределения ГЛС по разработанной методике показала, что вследствие разложения исходных веществ и образования артефактов не наблюдается необходимой точности, прецизионности и линейности измерений.

В связи с этимметодика ГХ/МС без дериватизации пригодна только для ориентировочнойоценки содержания ГЛС в пробе, и полученные данные нельзя использоватьдля вынесения достоверного заключения о количестве анализируемого вещества в объекте.3.2.1. Применение разработанной методикиРазработанная методика была успешно применена для скрининга мочибольных с острыми отравлениями ГЛС.

Помимо исходных соединений и артефактов в большинстве проб были обнаружены некоторые метаболиты ГЛС.При этом пики, соответствующие метаболитам, не выявляются на хроматограммах образцов мочи, в которых ГЛС изначально отсутствовали, но былидобавлены в виде стандартных растворов. Идентификация метаболитов является дополнительным подтверждением наличия того или иного ГЛС и исключает как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты.67Ниже приведены некоторые примеры использования методики прискрининге ГЛС в моче больных с признаками острых отравлений соответствующими препаратами.RT: 5.84 - 11.7910.18100NL:7.65E7TIC MS5942urA_hyp2908.5580Relative Abundance709.4560504011.136.039.793010.23206.367.041010.6511.377.487.797.008.408.66 8.8210.7506.06.57.07.58.08.59.0Time (min)9.510.0tR, минВещество6,03Дифениламин (внутренний стандарт)9,45Метопролол10,18Метопролол, формил.

артефакт10,65Пропранолол11,37Пропранолол, формил. артефакт11,84Метопролол, метаболит10.511.0Рисунок 15. Хроматограмма пробы мочи пациентки Р.11.568RT: 5.54 - 15.196.70100NL:1.43E8TIC MS16374_hyp2_2mkl9080Relative Abundance707.796050407.39 7.50308.296.038.422012.188.89 8.949.047.31109.80 9.8510.5111.6413.4911.7912.9513.7714.7913.87067891011Time (min)12131415tR, минВещество6,03Дифениламин (внутренний стандарт)11,79Дегидронифедипин12,18Дегидронифедипин-карбоновая кислота13,77Дегидронифедипин лактон14,58Нифедипин (под фоном, идентифицирован по m/z 329)14.77Дегидронифедипин-гидроксикислотаРисунок 16.

Хроматограмма пробы мочи пациента С.69RT: 5.35 - 25.7110.28100NL:5.79E8TIC MS6825urA9080Relative Abundance70605040307.752024.836.64106.0014.968.507.199.9812.14 13.4306810121415.17 17.6916Time (min)18.1919.62182021.42 21.61 23.792224tR, минВещество6,00Дифениламин (внутренний стандарт)10,28Верапамил, метаболит N-дезалкил13,43Верапамил, метаболит N-дезалкил ацетилированный24,57Норверапамил (под фоном, идентифицирован по m/z 289)24,83ВерапамилРисунок 17. Хроматограмма пробы мочи пациентки А.70RT: 8.86 - 18.959.53100NL:4.56E8TIC MS6584urA908012.36Relative Abundance706014.185015.04 15.1414.974012.213018.2314.00209.9110.68 11.661012.0617.7712.86 13.1715.3215.609.1416.19 16.82091011121314Time (min)15161718tR, минВещество9,14Дифениламин (внутренний стандарт)14,97Атенолол (пик перегружен)15,27Атенолол, формил.

Артефакт (под пиком атенолола, идентифицирован по m/z 127)17,99Эналаприла дикетопиперазинРисунок 18. Хроматограмма пробы мочи пациентки П. (хроматограммаполучена с использованием исходной температурной программы)71RT: 5.80 - 19.2212.81100NL:6.92E7TIC MS6637urA_1110070953589080Relative Abundance706012.12508.54406.683018.276.032011.12107.47 7.779.4813.4910.2310.4411.9813.77 14.7015.7416.4816.9818.450678tR ,910111213Time (min)1415161718Веществомин6,03Дифениламин (внутренний стандарт)6,40Бисопролол, метаболит12,12Бисопролол12,81Бисопролол, формил.

артефактРисунок 19. Хроматограмма пробы мочи пациентки Н.1972ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯГИПОТЕНЗИВНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ В ПЛАЗМЕКРОВИ ЧЕЛОВЕКА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ТАНДЕМНЫМ МАСССПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ4.1. Материалы и методы4.1.1. ОборудованиеИспользовался жидкостный хроматомасс-спектрометр LCMS-8040(система жидкостной хроматографии Nexera с тройным квадрупольным массспектрометром, Shimadzu, Япония), укомплектованный системой ионизацииDUIS (обеспечивает одновременное использование электрораспыления (ESI)и химической ионизации при атмосферном давлении (APCI)), системой градиентного элюирования, термостатом колонок CTO-20AC с диапазоном температур 4 – 90°С.Для приготовления растворов и проведения пробоподготовки использовалось следующее оборудование: Весы лабораторные Shimadzu AUW 120D (Shimadzu, Япония); Вортекс-шейкер V-3 SkyLine (Elmi, Латвия); Ультрацентрифуга Eppendorf Centrifuge 5427 (Eppendorf, Германия) Дозатор переменного объёма Eppendorf Research® plus 100-1000 мкл(Eppendorf, Германия); Дозатор переменного объёма Eppendorf Research® plus 10-100 мкл(Eppendorf, Германия).4.1.2.

Растворы и реактивыПри приготовлении подвижных фаз, стандартных растворов, детектирующих растворов, пробоподготовке были использованы следующие реактивы:73 метанол (extra pure, Scharlau, Испания) ацетонитрил (supergradient, Scharlau, Испания) кислота муравьиная (for LC-MS, Merck Millipore, США) формиат аммония (for LC-MS, Merck Millipore, США) вода деионизованная, электрическое сопротивление 18,2 МОм*см,Millipore simplicity UV (Merck-Millipore, США) образцы плазмы крови человека, не содержащие анализируемых веществ (интактная, или бланковая, плазма)4.1.3. Стандартные образцы Атенолол (≥98%, SIGMA, годен до 10.2015) Бисопролола гемифумарат (≥98%, SIGMA, годен до 04.2016) Верапамила гидрохлорид (≥99%, SIGMA, годен до 03.2016) Метопролола тартрат (вторичный стандарт, соответствует USP,SIGMA-ALDRICH, годен до 06.2016) Нифедипин (≥98%, SIGMA, годен до 05.2016) Пропранолола гидрохлорид (вторичный стандарт, соответствуетUSP, SIGMA-ALDRICH, годен до 08.2017) Эналаприла малеат (вторичный стандарт, соответствует USP,SIGMA-ALDRICH, годен до 11.2015) Эналаприлата дигидрат (≥98%, SIGMA, годен до 07.2016)4.1.4.

Приготовление растворов и пробоподготовкаИсходный стандартный раствор готовили, помещая около 10,00 мг ГЛСв мерную колбу вместимостью 100 мл, далее добавляли 50 мл метанола, растворяли ГЛС, доводили объём раствора до метки метанолом и перемешивали. Массы навесок ГЛС и концентрации исследуемых веществ в исходномстандартном растворе приведены в таблице 14.Далее путём разведения исходного раствора готовили серию из семирабочих стандартных стандартных растворов ГЛС (таблица 15).74Таблица 14.Массы навесок ГЛС и концентрации исследуемых веществ в исходномстандартном растворе.Навеска,ВеществоКонцентрация, мкг/мл, в пересчёте на основание и с учётоммгАтенололчистоты образца10,0098,00гемифумарат10,0684,50Верапамила гидрохлорид10,3795,40Метопролола тартрат9,8876,08Нифедипин9,8196,14гидрохлорид10,6391,42Эналаприла малеат10,3077,25БисопрололаПропранололаТаблица 15.Приготовление рабочих стандартных растворов и концентрации в нихГЛС.Калибровочный уровень12345670,100,250,502,502,502,502,50200100100100502010Исходногостандартногораствора, млМетанола до,млВеществоКонцентрация, нг/млАтенолол49,00 245,00 490,00 2450,00 4900,00 12250,00 24500,00Бисопролол42,25 211,26 422,52 2112,60 4225,20 10563,00 21126,00Верапамил7547,70 238,51 477,02 2385,10 4770,20 11925,50 23851,00Метопролол38,04 190,19 380,38 1901,90 3803,80Нифедипин48,07 240,35 480,69 2403,45 4806,90 12017,25 24034,509509,5019019,00Пропранолол 45,71 228,55 457,09 2285,45 4570,90 11427,25 22854,50Эналаприл38,63 193,13 386,25 1931,25 3862,509656,2519312,50При проведении пробоподготовки к 500 мкл исследуемой либо 400 мклинтактной плазмы с добавлением 100 мкл рабочего стандартного раствораприбавляли 700 мкл ацетонитрила, встряхивали в течение 30 сек на вортексшейкере, и центрифугировали 15 мин со скоростью 14500 об/мин на центрифуге.

Надосадочную жидкость переносили в виалы и помещали их в автосамплер хроматографа.Пробоподготовка путём осаждения белков плазмы ацетонитрилом даетневысокую степень извлечения на низких и средних калибровочных уровнях(30-50%, кроме нифедипина), однако даже в этих условиях удаётся добитьсянПКО порядка 10 нг/мл для всех изучаемых ГЛС, что в сочетании с простотой и экспрессностью позволяет признать осаждение белков ацетонитриломоптимальным способом пробоподготовки при анализе острых отравлений.При определении эналаприла и эналаприлата исходный стандартныйраствор готовили, помещая около 10,00 мг ГЛС в мерную колбу вместимостью 100 мл, далее добавляли 50 мл метанола, растворяли ГЛС, доводилиобъём раствора до метки метанолом и перемешивали.

Массы навесок ГЛС иконцентрации исследуемых веществ в исходном стандартном растворе приведены в таблице 16.Далее путём разведения исходного раствора готовили серию из семирабочих стандартных стандартных растворов ГЛС (таблица 17).76Таблица 16.Массы навесок эналаприла малеата и эналаприлата дигидрата и концентрации их оснований в исходном стандартном растворе.ВеществоНавеска,Эналаприла малеатмгКонцентрация, мкг/мл в пересчёте насвободное основание и с учётом чистоты образца13,3310,0011,0410,00Эналаприлата дигидратТаблица 17.Приготовление рабочих стандартных растворов эналаприла и эналаприлата.Калибровочный уровеньИсходного стандартногораствора ГЛС, млМетанола до, мл1234560,500,751,252,500,751,002001001001002020ВеществоКонцентрация, нг/млЭналаприл25,00 75,00 125,00 250,00 375,00 500,00Эналаприлат25,00 75,00 125,00 250,00 375,00 500,00При проведении пробоподготовки для определения эналаприла и эналаприлата к 400 мкл исследуемой либо 320 мкл интактной плазмы с добавлением 80 мкл рабочего стандартного раствора прибавляли 800 мкл ацетонитрила, встряхивали в течение 30 сек на вортекс-шейкере, и центрифугировали15 мин со скоростью 14500 об/мин на центрифуге.