Диссертация (Химико-токсикологический анализ гипотензивных лекарственных средств при острых отравлениях), страница 5

Чембольшее значение имеет данная величина, тем меньше сродство соединения кводе, соответственно, тем лучше оно изолируется органическими растворителями [18].Отрицательный десятичный логарифм константы кислотности (pKa)позволяет классифицировать ГЛС как вещества с преобладанием кислотныхили основных свойств. Наибольший выход экстракции органическими растворителями достигается, если вещество в пробе находится в неионизированной форме. В соответствии с уравнением Гендерсона-Гассельбаха это условие выполняется для слабых оснований при pH=pKa+2, а для слабых кислот при pH=pKa-2 [18, 28, 29]. Среди исследуемых ГЛС есть как вещества,относящиеся к слабым основаниям (атенолол, бисопролол, верапамил, метопролол, пропранолол), так и сочетающие слабые кислотные и слабые основные свойства и способные к образованию в растворе цвиттер-ионов (эналаприл) [34].

Для нифедипина в литературе не приводится достоверного экспериментального значения pKa и данное вещество в обычных условиях не демонстрирует заметных кислотных или основных свойств. В связи с указанными выше особенностями исследуемых ГЛС можно заключить, что все онимогут быть извлечены из биологических проб органическими растворителями при слабощелочных значениях pH.

Эналаприл также может быть извлеченпри незначительном подкислении пробы.В лекарственных формах и в доступных стандартных образцах ГЛСобычно находятся в солевой форме, в то время как в биологических жидкостях они определяются в виде свободных оснований или кислот. В солевойформе исследуемые соединения хорошо растворимы в воде, однако исключение составляет атенолол, который растворяется в воде в форме основания.321.5. Методы лабораторного обнаружения гипотензивных лекарственныхсредств в биологических жидкостях человекаАнализ ГЛС в биожидкостях человека может производиться различными аналитическими методами.

Существуют методики определения исследуемых веществ хроматографических методов: газовой (ГХ), тонкослойной(ТСХ), высокоэффективной жидкостной (ВЭЖХ) и сверхвысокоэффективнойжидкостной хроматографии (СВЭЖХ). Также возможно применение иммунохимических методов анализа.Для эналаприла существует методика его обнаружения в плазме кровис применением метода иммуноферментного анализа [35], однако для остальных веществ, в частности, для БАБ не разработаны высокоселективные иммунные методы. Данный факт можно объяснить относительной простотойструктуры исследуемых соединений и их низкой молекулярной массой, чтоне позволяет создавать специфические антитела для данных соединений [36].В связи с этим на данный момент иммунные методы нельзя признать пригодными для химико-токсикологического анализа ГЛС при острых отравлениях без использования иных подтверждающих аналитических методов.МетодТСХ, несмотряна егобольшое значение в химико-токсикологическом анализе [37, 38], не находит на данный момент широкогоприменения при анализе острых отравлений ГЛС.

В основном, данный методприменяется в фармакопейном анализе изучаемых веществ для подтверждения подлинности и определения примесей [39 – 44]. Описана методика обнаружения верапамила в плазме крови методом ТСХ [45]. В указанной работепредел обнаружения верапамила составляет 0,5 мкг/мл, что позволяет применять методику в химико-токсикологическом анализе. Однако предлагаетсятрудоёмкий способ пробоподготовки путём твердофазной экстракции (ТФЭ),что увеличивает время анализа.

Наиболее полную информацию об использовании ТСХ при диагностике острых отравлений ГЛС можно обнаружить всборнике Кларка [18], где, тем не менее, даны лишь общие рекомендации повыбору хроматографической системы и способа детектирования.33Газовая хроматография является более чувствительным методом химико-токсикологического анализа по сравнению с ТСХ [38]. Особенно большоераспространение в химико-токсикологическом анализе и, в частности, в определении ГЛС при острых отравлениях имеет метод газовой хроматографии/ масс-спектрометрии (ГХ/МС) [46 – 52]. Описаны методики их определениякак в нативном виде [42], так и после дериватизации [46, 53, 54].Достоинствами газовой хроматографии / масс-спектрометрии (ГХ/МС)являются высокая эффективность разделения компонентов пробы, чувствительность, селективность, сочетание скрининга и подтверждающего анализав одном методе [54].

Большие преимущества ГХ/МС в рутинном анализе даётналичие обширных и доступных библиотек масс-спектров [55, 56].В случае анализа ГЛС становятся очевидны некоторые недостаткиГХ/МС. Данные вещества не обладают достаточной термической стабильностью и в значительной степени разлагаются в хроматографе, что уменьшаетчувствительность и воспроизводимость метода, исключает возможность ихколичественного определения в пробе [57 – 59]. Описаны многочисленныеметодики анализа ГЛС методом ГХ/МС с дериватизацией [46, 53, 54], позволяющие решить данную проблему. Однако стадия дериватизации усложняетпробоподготовку и увеличивает время анализа, тогда как при лабораторнойдиагностике острых отравлений, напротив, желательно максимально сократить время исследования [60].

В случае передозировки гипотензивными ГЛСконцентрация токсиканта в крови и моче значительно превышает терапевтический уровень, таким образом, становится возможным применение ГХ/МСбез дериватизации.Наиболее распространённым на сегодняшний день аналитическим методом для определения лекарственных в биологических жидкостях являютсяВЭЖХ и СВЭЖХ [61 – 72]. Методы лишены недостатков ГХ, связанных стермолабильностью лекарственных веществ, и имеет большую чувствительность, особенно в случае тандемного масс-спектрометрического детектирования (ВЭЖХ-МС/МС) [73]. Важным аспектом масс-спектрометрического34детектирования при проведении биоаналитических исследований являетсянеобходимость оценки эффекта матрицы, который заключается в усиленииили ослаблении сигнала детектора за счёт взаимодействий анализируемыхсоединений с прочими компонентами пробы в процессе ионизации [74 – 77]Помимо выбора аналитического метода огромное значение при разработке биоаналитических методик имеет выбор подходящего способа пробоподготовки.

Для биожидкостей чаще всего применяются три метода: ЖЖЭ[78 – 80], ТФЭ [77, 80 – 84] и осаждение белков [80, 85 – 89].В ГХ с использованием капиллярных колонок для неполярных и слабополярных соединений критическое значение для нормального функционирования оборудования и получения достоверных результатов анализа имеет отсутствие воды во вводимой пробе [90]. В связи с этим при пробоподготовкимочи, плазмы и сыворотки крови в данном случае неприменим метод простого осаждения белков, так как после указанной процедуры в пробе остаетсябольшое количество воды.

Чаще всего при пробоподготовке биологическихжидкостей методом ГХ используют ЖЖЭ и ТФЭ [46 – 52].В методе ВЭЖХ наличие в пробе воды не является критическим фактором, поэтому широко применяются все три указанных выше способа пробоподготовки. ТФЭ и ЖЖЭ позволяют проводить концентрирование вещества в пробе и получать экстракты, содержащие незначительное количество загрязняющих компонентов эндогенного происхождения, однако методикипробоподготовки с использованием ЖЖЭ и ТФЭ обычно состоят из нескольких стадий, требуя от аналитика большой затраты времени и концентрациивнимания.

Осаждение белков плазмы является самым простым и быстрымспособом подготовки биопроб, однако в получаемом экстракте содержитсябольшое количество загрязняющих компонентов эндогенного происхождения, что может негативно сказаться на работе аналитического оборудования.Для решения данной проблемы необходим правильный выбор осаждающегореагента с учётом физико-химических свойств анализируемых веществ иподбор оптимального соотношения биожидкость-осадитель [89]. Для боль-35шинства случаев отлично подходит использование в качестве осадителя ацетонитрила в двух- или трёхкратном избытке в сравнении с объёмом анализируемой биожидкости.В таблице 7 кратко представлены данные исследований по лабораторному обнаружению ГЛС хроматографическими методами. Важнейшимикритериями применимости методик в химико-токсикологическом анализеГЛС являются нижний предел количественного определения (нПКО) и линейный диапазон методики.Таблица 7.Аналитические методики определения гипотензивныхлекарственных средств в биологических жидкостях человекаВеществоВерапамилОбъектПлазмаМетодТСХПробопод-АналитическийСсыл-готовкадиапазон, нПКОкаТФЭПредел обнару-[45]жения – 0,5мкг/млАтенололБиожид- ТСХТФЭ,20 нг в пятне наБисопрололкостиЖЖЭ,хроматограммеМетопрололОсаждениеПропранололбелков[91]ВерапамилНифедипинАтенололБисопрололМочаГМ-МСЖЖЭ, де-40,1 нг/мл (ме-риватиза-тилборонат); 14,4циянг/мл (TMS-TFA)8,51 нг/мл (метилборонат);15,8 нг/мл (TMSTFA)[36]36Метопролол1,2нг/мл (ме-тилборонат);8,4нг/мл (TMS-TFA)Пропранолол23,3 нг/мл (метилборонат); 3,44нг/мл (TMS-TFA)АтенололМочаБисопрололВЭЖХ-Гидролиз,0,69 нг/млМСЖЖЭ0,72 нг/млМетопролол0,53 нг/млПропранолол1,73 нг/млАтенололБио-Метопрололжидко-ГХ-МСПропранолол стиАтенололПлазмаЭналаприлЖЖЭ, де-5-100 мкг/млриватиза-1,25-100 мкг/млция2,5-100 мкг/млВЭЖХ-Осаждение 2-1000 нг/млМС/МСбелковБисопролол[53][92]3,5-350 нг/мл1,5-150 нг/млАтенололКровь от ВЭЖХ-Осаждение 0,014 мкмольМетопрололтрупабелков и0,02 мкмольТФЭ0,014 мкмольМСБисопрололПропранолол0,014 мкмольВерапамил0,005 мкмольЭналаприл[36]Плазма–[93]ВЭЖХ-Осаждение 0,550МС/МСбелков,нг/млВерапамилупарива-0,69 – 200 нг/млБисопрололние, пере-0,51 – 38 нг/млНифедипинрастворе-2,00 нг/млМетопрололние0,66 – 500 нг/мл400Атенолол0,80 – 800 нг/млПропранолол0,38 – 200 нг/мл[94]ЭналаприлПлазмаВЭЖХ-37ЖЖЭ0,1 – 100 нг/мл[95]МС/МСЭналаприлПлазмаВЭЖХ-Осаждение 0,001–0,5 мкг/млМС/МСбелков,0,01–5 мкг/млПропранололупарива-0,001–0,5 мкг/млМетопрололние, пере-0,001–0,5 мкг/млВерапамилрастворе-0,001–0,5 мкг/млНифедипинние0,001–0,5 мкг/млАтенололЭналаприлЭналаприлЭналаприлПлазмаПлазмаПлазма[96]ВЭЖХ-Осаждение 0,638–255 нг/млМС/МСбелковВЭЖХ-Осаждение 0,1–150 нг/млМС/МСбелковВЭЖХ-ТФЭ0,2–200 нг/мл[99]ВЭЖХ-ЖЖЭ, пе-0,104 – 52,0[100]МС/МСрераство-нг/мл[97][98]МС/МСНифедипинПлазмарениеАтенололПлазмаПропранололВЭЖХ-ЖЖЭ, пе-МС/МСрераство-0.05 – 500 мкг/г[101]10-100 нг/мл[102]рениеМетопрололВерапамилНифедипинБисопрололАтенололМочаВЭЖХ-ТФЭМС/МСскринингПропранолол ПлазмаВЭЖХ-Осаждение 6,2 нг/млЭналаприлМС/МСбелковПропранололМетопрололБисопролол10,8 нг/мл[103]38Как следует из таблицы 7, наибольшее распространение при анализеГЛС в биологических жидкостях человека получил метод ВЭЖХ-МС/МС.Метод ТСХ демонстрирует наименьшую пригодность в силу недостаточнойчувствительности и трудностей при проведении количественного анализа.ГХ-МС требует сложной пробоподготовки и дериватизации анализируемых соединений для достижения широких аналитических диапазонов.нПКО описанных методик не гарантирует обнаружение ГЛС в плазме кровиметодом ГХ-МС, однако позволяет определять их в моче.

Таким образом, метод ГХ-МС пригоден для использования в качестве скринингового аналитического метода.Выше приведённые методики анализа ГЛС методами ВЭЖХ-МС иВЭЖХ-МС/МС разработаны для разных целей (химико-токсикологическийанализ, исследования биоэквивалентности, терапевтический лекарственныймониторинг, допинг-контроль), поэтому получаемый аналитический диапазон также не всегда пригоден для диагностики острых отравлений, а применяемая многими авторами многостадийная пробоподготовка не удовлетворяет требованию экспрессности химико-токсикологического анализа. Однакоописаны и относительно простые методики анализа с пробоподготовкой путём осаждения белков плазмы ацетонитрилом, не требующие больших затратвремени на предварительном этапе и обладающие достаточно широким аналитическим диапазоном.39ВЫВОДЫ К РАЗДЕЛУ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1. На основании данных статистики острых отравлений и информации онаиболее часто применяемых и доступных населению гипотензивныхлекарственных средствах для дальнейшего исследования выбраны следующие лекарственные средства: атенолол, бисопролол, верапамил,метопролол, нифедипин, пропранолол и эналаприл.2.