Заключение (Разработка и применение методов ПЦР и ИФА для анализа остаточных ДНК и белков штаммов-продуцентов в биофармацевтических субстанциях)

УТВЕРЖДАЮ: И.о, ректсув'в1г)Т~Й,"'йм, М.В. Ломоносова д.х.н., оф';Пф~фр. Оз.,)Ьф. »-,=;„,.„,~„~.~д; ...1; '.": .:,: 4 2015 г ЗАКЛК)ЧЕНИЕ Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова» (МИТХТ им. М.В. Ломоносова) по диссертационной работе Ковалевой Екатерины Викторовны на тему «Разработка и применение методов ПЦР и ИФА для определения остаточных ДНК и белков штаммовпродуцентов в биофармацевтических субстанциях» по специальности 03.01.06— Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Научный руководитель: Академик РАН, доктор химических наук, профессор кафедры биотехнологии и промышленной фармации Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.

В. Ломоносова» Швец Виталий Иванович. Обсуждение диссертации Ковалевой Е.В. проводилось 21 сентября 2015 года на заседании кафедры биотехнологии и промышленной фармацни ФГБОУ ВПО МИТХТ имени М.В. Ломоносова 1протокол № 2). На заседании присутствовали: зав. кафедрой, д.т.н., проф. Кеднк С.А,, д.х.н., проф., академик РАН Швец В.И., доц., к.х.н.

Сорокоумова ГМ., доц., к.х.н.. Шастина Н.С, доц,, к.х.н. Пшеничникова А.Б., доц., к.х.н. Чудинов М.В., доц., к.х.н. Кириллова Ю.Г., к.х.н., с.н.с. Лютик Диссертация Ковалевой Е.В, «Разработка и применение методов ПЦР и ИФА для определения остаточных ДНК и белков штаммов-продуцентов в биофармацевтических субстанциях» выполнена в Контрольно-аналитической лаборатории Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт биоорганической химии имени академиков М. М.

Шемякина и Ю. А. Овчинникова» РАН и на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова». В 2008 г. окончила ФГБОУ ВПО МИТХТ им.

М.В. Ломоносова по специальности «Биотехнология». В 2015 г. окончила обучение в очной аспирантуре на кафедре биотехнологии и бионанотехнологни ФГБОУ ВПО МИТХТ им. М.В, Ломоносова по специальности «Биотехнология». Удостоверение о сдаче кандидатских экзаменов № 50-15 выдано «01» октября 2015 года. А.И., к.х.н., ст.

преп. Еремин С.В., к.х.н., доц. Лукин А.Ю., к.х.н., н.с. Матвеев А.В., к.х.н., доц. Есипова О.В„к.х.н., доц. Панов А.В. В ходе обсуждения были заданы следующие вопросы: Вопросы проф., д.п.н. Кедика С.А.: 1) Разработанные методики имеют внедрение технологического характера или были внесены изменения в Фармакапейную статью предприятия? Ответ 1: Разработанные методики ПЦР в реальном времени и ИФА внедрены в технологию Опытного биотехнологического производства ИБХ РАН и в разрабатываемую нормативную документацию. 2) То есть стадия стерильной фильтрации на этапе приготовления готовой лекарственной формы устраняет возможность образования неспецифического пика на кривой плавления продуктов ПЦР в реальном времени? Ответ 2: Действительно, именно стадия стерильной фильтрации устраняет допустимую микробиологическую контаминацию, имеющую место в активной фармацевтической субстанции инсулина и гистона Н1.3.

При этом готовые лекарственные формы стерильны, и в них отсутствует отличный от контроля пик, что подтверждено кривыми плавления продуктов ПЦР в реальном времени. Вопросы доц., клин. Н С. Шастиной: 1) Каким образом гистон Н1.3 связывается с ДНК? Ответ 1: Гнстоны участвуют в образовании нуклеосом в ядрах эукариот. Гистон Н1.3 заряжен положительно за счет остатков лизина и аргинина, молекула ДНК имеет отрицательный заряд.

За счет сил электростатического взаимодействия образуется прочный комплекс ДНК-гистон Н1.3. 2) После трипсинолиза активной фармацевтической субстанции гистона Н1.3 остаются низкомолекулярные фрагменты, могут лн онн связываться с остаточной ДНК в субстанции и ингибировать ПЦР? Ответ 2: Отсутствие ингибирования ПЦР, обусловленное присутствием в реакции низкомолекулярных фрагментов трипсинолизированного гистона Н1.3, подтверждено методом добавок.

В пробирку с трипснолизированной активной фармацевтической субстанцией гистона Н1.3 вносили рабочий стандартный образец ДНК, При этом после прохождения реакции был виден сигнал, соответствующий контролю,что подтверждено данными электрофореза продуктов ПЦР в 1,5',4 агарозном геле в присутствии этидия бромида. Вопрос доц.,к.х.н. ГМ. Сорокоумовой: 1) Каким образом разводили стандарты для калибровочных кривых разработанного метода ПЦР? Ответ 1: Калибровочные растворы рабочего стандартного образца ДНК готовили последовательными десятикратными разведениями, со спектрофотометрическим контролем в 2 мкл раствора на планшете ХапоЯпап1, ТЕСАХ. 2) В каких единицах измерения представлены концентрации стандартов калибровочных кривых для ПЦР перед их логарифмированием? Ответ 2: Стандарты калибровочных кривых ДНК для разработанного метода рвПЦР представлены в единицах измерении - фемтограммах 1фг), что соответствует 10 г.

-! 5 С оценкой работы выступили: В,И. Швец, Шибанова Е.Д., Шастина Н.С., Сорокоумова Г.М. Они отметили, что работа Ковалевой Е.В. представляет собой весьма актуальный, охватывающий несколько объектов исследования, полностью завершенный научный труд. Результаты исследований в рамках диссертации включены в нормативную документацию Опытного биотехнологического производства ИБХ РАН.

Разработанные специфичные и высокочувствительные методики активно используются на стадии контроля примесей ДНК и белков в производимых активных фармацевтических субстанциях. Результаты исследования опубликованы в ведущих журналах и были представлены на Международных научнопрактических конференциях.

Диссертацию Ковалевой Е.В. следует рекомендовать к защите на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 03.01.06 «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)». После обсуждения на заседании кафедры принято заключение по диссертнционной работе Ковалевой Е.В. Актуальность работы Одной из важнейших задач при производстве лекарственных форм, на основе генно- инженерных белков, является разработка более совершенных методов контроля качества продукции.

На начальных этапах разработки метода определения содержания примесей в активной фармацевтической субстанции используют коммерческие наборы. Затем разрабатывают более чувствительный и специфичный метод для конкретной технологии производства, В основу данной работы положена разработка методов рвПЦР и ИФА для выявления остаточнъгх производных штамма продуцента Е.со11 на примере двух АФС генно-инженерного инсулина человеческого и генно-инженерного гистона Н1.3 человеческого, с четким подбором компонентов системы и параметров метода для каждого исследуемого объекта. Рассматриваемые в данной работе активные фармацевтические субстанции являются основой препаратов, крайне важных для лечения сахарного диабета и онкологических заболеваний. Личное участие соискателя ученой степени в получении результатов, изложенных в диссертации, являлось первостепенным и непосредственным на всех этапах работы.

Принимала активное участие при постановке цели исследования и разработке теоретических и экспериментальных подходов для решения поставленных задач. Автор лично выполнял экспериментальную часть работы, а также обрабатывал экспериментальные данные и интерпретировал полученные результаты. Также автор принимал участие в подготовке публикаций по выполненной исследовательской работе. Степень достоверности результатов проведенных соискателем ученой степени исследований Выносимые автором на защиту научные положения являются результатом исследований, полученных с помощью комплекса генно-инженерных, иммунологических, физико-химических и микробиологических методов анализа. Полученные данные достоверны, адекватно интерпретированы, выводы грамотно обоснованы. Приемлемость и достоверность полученнъгх данных оценивалась: 1) с помощью методов статистической обработки полученных результатов и валидационных испьгганий; 2) При помощи методов генной инженерии, ПЦР и ПЦР в реальном времени; 3) при использовании электро форетичес кого разделения белков и ДНК для визуализации результатов проведенных исследований; 4) с помощью иммунологических и физико-химических методов анализа ИФА, спектрофотометрии; 5) при использовании микробиологических методов.

Научнаи новизна и практическая значимость результатов проведенных соискателем ученой степени исследований Научная новизна. Разработан новый высокочувствительный и специфичный метод ПЦР в реальном времени с использованием праймеров к гену 16Б РНК штаммов-продуцентов генноинженерного инсулина и гистона Н1.3 человеческого, с применением красителя БУВК ОКЕЕМ 1 и технологии Тас)Мап. Рассматриваемый метод имеет несомненное преимущество в сравнении с ПЦР в реальном времени при использовании праймеров к плазмидной ДНК штамма-продуцента. Праймеры к плазмидной ДНК не позволяют оценить реальное содержание остаточной тотальной ДНК, поскольку количество геномной ДНК штамма в АФС минимум на порядок превьппает количество плазмидной ДНК.