Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 150
Текст из файла (страница 150)
Рекомбинантная ДНК не интегрирует в хромосому и сохраняется непродолжительное время, поэтому при проведении генотерапии с использованием аденовирусных векторов необходимо вводить их с определенной периодичностью. Аденовирусцые векторы использовали в клинических испытаниях по генной терапии муковисцндоза.
Первые результаты не обнадеживали: ген трапсмембранного регуляторного белка, нарушения в котором приводят к муковисцидозу (СРТК„ от англ. гуз//с 1/Ьгоз/з /гапхтетЬгапе геди/а/ог), был перенесен лишь в небольпюе число кле|ок пациента, а мноюкратное ввеление рекомбинаптного япеновируса и низкий уровень экспрессии некоторых аденовирусных генов привели к развитию у пациентов выраженного иммунного ответа и гибели трансдуппрованных клеток. Зту проблелзу решали разными путями. Например, сконструировали»пакующую» клеточную линию, содержащую Е!-область и рял яленовируспых генов, которые не входят в состав зрансду1 !ируюгцей ДН К и нс попадают в клетки- мишени.
Затем удалось добиться тою, чтобы ни Один из яденови)зусных генов не Вкчючзлся в трансдуцирующую ДНК. Для этого линеарнзовали плазмиду Е. со//(28 т. п, и.), которая обеспечивает экспрессию олного или большего числа терапевтических генов и не содержит аленовирусных генов, и припзили к ее концам фрагменты ДНК (по 4 т.
п. п.), содержащие точку начала репликации яденовирусной ДНК, последовагелыюсть, ответственную за ее упаковку, и сигнал терминации. Длина продукта лигирования (36 т. и. и.) соответствует длине полноразмерного генома аденовируса. Затем полученным прочуктом и аденовирусным гено- Генная терапия 495 1ОО Клетка-хозянн ефектные реплнхацнн усные частицы Клетка-ми»пень Рис.
21.7. Аленовирусный вектор. В клюку-хозяина, несущую интегрированный в гецомнуюДНК функциональный ген Е! аденовнруса, вводят встроенную в сегмент аденовирусного генома (0-17 единицы карззя) нлазмиду с х»гераггевгическим» геном (ТГ) н участок генолшой ДНК аденовируса (9 — 100 единицы карты). Длина генол~а аденовируса равна 100 едиинцам. В результате рекомбинации (штриховая линия) между перекрывающимися участкамн цлазмнлы и ДНК аденовируса образуется молекула ДНК, эквивалентная полноразмерному вирусному генону.
Рекомбинангная ДН'К, солержашая »терапевтический» ген, упаковывается и высвобождается из клетки после ливиса. Образующиеся вирусные частицы дег)зектны но ренликации. Нлазмндная ДНК, входящая в состав конечной генетической конструкции, не влияет на упаковку рекомбинантной ДНК (не показано). 49б ГЛАВА 21 мом без Е1-области и последовательности, ответственной за упаковку, провели котрансфекпик1 клетки-хозяина, экспрессирующей Е1-гены. Молекула ДНК аденовируса, дефектная по репликации и упаковке, поставляет гены лля сигпеза комсюнентов вируса, а с1ролукт лигирования реплицируется и упаковывается в вирусные частицы.
При этом стколо 99% высвобождаемых вирусных частиц солержат молекулу ДН К с «терапевти сеским» геном (генами). С помощью цептрифугиролания их можно отделить от лефектных по репликации вирусов, которые все же образуются в незначительном количестве. ДН К-клонирующая емкость такой системы достигает 23 т. п. н. Эффективность аденовирус-опосредованного переноса генов можно повысить, если сконструировать вирус, проникающий преимущественно в определенную клетку-мишень.
Для этого в ген, ответственный за образование нитей аденовируса, следует включить последовательность, кодирукзссгую домен белка, который связываесся с клеточпоспецифичным рецептором. Векгпоры на овсове аденоассос(иированных вирусов Аденоассоциированные вирусы (ААВ) — это небольшие непатогенные вирусы человека с одноцепочечным ДНК-геномом (4,7 т. и, н.), который может игпегри ровать в специфический сайт 19-й хромосомы. Такое название они получили потому, что для продуктивной инфекции им необходимы белки другого вируса (вируса-помощника), например аденовируса. После того как АЛВ попадает в ядро, есо геном с помогдью полимераз клетки-хозяина преобразуется в двухцепочечную ДНК и трапскрибируется. Отсутствие патогенности делает АЛВ весьма перспективным вектором для доставки в организлс человека «терапевтических» генов.
Рекомбинантный ААВ получают с помогцью котрансфекпии клетки-хозяина, инфицированной каким-нибудь аленовирусом (вирусом-помощником), двумя плазмидами (рис. 2 !.8). Олна из них несет «терапевтический» ген, фланкированный инвертированными концевыми повторами (длиной от 125 п. н.) ЛЛВ, а вторая — лва его гена, гер и сар, ответственные за репликацию генома и синтез капсида соответственно. После лизиса инфицированных клеток рекомбинантные АЛВ отделяют от аденовируса с помощьк1 центрифугировапия и Лиализа, а оставшиеся в образце аденовирусы (вирусы герпеса) ипактивируют нагреванием.
Рекомбинантный АЛВ может нести ДНК-вставку размером до 4,5 т. п. н., пе вызывает развития иммунного ответа, поскольку пе солержит ААВ-генов, по и не может сснтесрировазь в 19-кз хромосому из-за отсутствия гена гер. В одном из доклинических испьпаний эс)х)ективность (п ззхзз транслукпии гепатоцитов мыши (рекомбинан.гный' ААВ вводили внутривенно) была повышена в 900 раз с помощью предварительного облу сенин печени нетоксическими лозами и введения нерекомбинантного (ликого типа) АЛВ.
В этом случае кДНК фактора !Х системы свертывания крови («терапевтический» геп) экспрессировалась в течение как минимум 5 мес на уровне, достаточном лля коррекции дефекта при гемофилии. В ! фазе клинических испытаний по генной терапии муковисцидоза в легкие вводили СгТЯ-АЛВ-вектор; при этом не развивалась воспалительная реакция, а вектор сохранялся ло 70 сут.
Чтобы определить, образуется ли продукт гена Сг7В в количестве, достаточном для достижения терапевтическосо эффекта, нужны дальнейшие клинические испытания. Векгноры на основе вируса просгнюго гергсеса Для того чтобы ретро- и аденовирусные векторы инфипировали специфические типы клеток, нужно мопифицировать их с помосцью генной инженерии, однако в природе существуют вирусы, уже обладающие сродством к определенному Рис.
2!.8. Вектор на основе аденоассоциированного сьзрусз (ААВ). Проведена козраосфекояя «лез хи-хозяина, инфицированной аденовирусом-помощником, двумя плюзмядами, одна из которых солержко «терапевтический» ген (ТГ). фланкированный инвертированными концевыми повторами (ПВ) ЛЛВ, а лругая — ~ены ААВ, ответственные за рецликацию (г«р) и формирование капсида (сер), которые находятся пол косп ролем нромотора (р), и последовательность полиаденилирования (ро). Высвоболившиеся после лизиса частицы рекомбинасггного ААВ и аденовируса разделякп центрссфупзрованием, а оставшиеся аденовируеяые частицы ияактивируют нагреванием. 498 ГЛАВА 21 типу клеток.
!ах, вирус простого герпеса 1 типа (НЯ~) инфицирует нейроны и персистирует в них, часто вызывая у человека так называемые «простудные» высыпания, а иногда — энцефалит с летальным исходом. Вирус присутствует в нейронах в латентной «)зорые, а при стрессе и гормональных нарушениях инициируется лнтический цикл. Существует множество заболеваний, поражакяпих центральную и периферическую нервную систему: опухоли, метаболические и иммунные нарушения, нейродегенерат ивные заболевания (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона). Неврологические заболевания, как правило, бывают хроническими и привод»п к госпитализации больного чаще, чем все остальные болезни вместе взятые.
Вследствие тропности НВЧ к нервным клеткал| он является подходящим вектором для генной терапии таких заболеваний. Геном НЯЧ представляет собой лвухцепочечную молекулу ДНК длиной 152 т. и. и. Капсид вируса сливается с мембраной нейрона, н его ДНК транспортируется в ядро. Репродуктивный цикл вируса состоит пз литической (репликация ДНК и образование вирусных частиц) и латентной (конденсапия вирусно1о генома и активация как минимум двух так называемых латентно-ассоциированных промоторов) фаз. Замена сегмента генома длиной примерно 30т.и.
н. ДНК-вставкой не оказывает заметного влияния на репликацию НЯЧ, его упаковку или инвазионную способность. С лругой стороны, большой размер генома НБЧ затрудняет генетические манипуляции с ним. Для решения этой проблемы в плазмиду Е, со!1, которая может переносить до 8 т. и. и. чужеродной ДНК, встроили «усеченный» 1еном НЬЧ, состоящий из точки инициации репликации и последовательности„ответственной за упаковку. Полученные НБЧ-производные назвали ампликонами (ампликон-плазмидами). Большинство систем досгавки генов на основе НЯЧ предполагает использование вируса-помощника, который поставляет белки, необхолимые для репликации и сборки вируса, но не образует инфекционные вирусные частицы, поскольку его геном модифицирован и не способен упаковываться.
Для получения рекомбинантного НЬЧ осушествляк»т трансфекцию амнликон-плазмиды в инфицированную вирусом-помошником клетку-хозяина. ДНК ампли- кона реплицнруется по типу «катящегося кольцам внутренняя кольцевая цепь играет роль матрицы, а во внешней происхолит разрыв, и к свободной 3'-концевой ОН-группе ковалентно присоеднняк1тся нуклеотиды. Растущая цепь представляет собой линейную тандемную последовательность сегментов, комплементарных внутренней цепи, и, отсоединяясь от нее, сама становится матрицей для синтеза комплементарной цепи. В результате образуется линейная двухпегючечная молекула — множественная кошш ампликона. Длина каждого ампликона составляет 15 т. и. н., поэтому набор из 10 тандемных копий соответствует полноразмерному геному НВЧ и упаковывается в НВЧ-капсид (рис.
21.9). Рекомбинантный НБЧ можно получить н с помощью котрансфекцни клеток-хозяев, в которых вирус может реплнцироваться, с помощью ДНК НБЧ дикого типа и плазмиды, которая содержит «терапевтический» ген, фланкированный последовательностями ДНК из вспомогательных участков НЯЧ-генома. ДНК НЯЧ дикого типа реилицируется в ядре клетки-хозяина, при этом в результате рекомбинации «терапевтический» ген может встроиться в НЯЧ-геном. Затем частицы как рекомбинантнопь так н дикого типа НЗЧ упаковываются и высвобождаются из клеток.
Доля рекомбинантных НЗЧ в общем вирусном пуле очень мала, поэтому вирусы размножают, а зател! с помощью ПЦР нлн гибридизации выявляют «терапевтический» геп в образовавшихся бляшках. Рекомбннантный вирус хранят в условиях, не допускающих его загрязнения НЗЧ дикого типа (рис. 21.10). Доклинические испытания на экспериментальных животных показали, что гены, доставленные с помощью НЯЧ-векторов в клетки мозга н периферической нервной систел~ы, экспресснрукпся и поддерживаются длительное время.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
