Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 148
Текст из файла (страница 148)
21.2). Жизненный цикл ретровируса включает слелуюшие стадии. Для получения рстровирусного вектора полноразмерную ДНК ретровируса встраивают в плазмилу, с помощью эндонуклеазного расщепления удаляют большую часть гена 8а8 и гены ро( и епв, оставляя 5 -концевой участок гена 8а8 и 5'- и 3'-(ТК, а затем рядом с 38 ' -областью встраивают «терапевтический» геп, транскрипция которого будет контролироваться 5'-ЕТК-промотором; прн необходимости можно встроить и маркерный селективныи ген с собственным промотором (рис.
21.3). Такая конструкция позволяет экспрессировать оба клонированных гена. На основе этой схемы созданы различные ретровирусные векторы. 1Чаксимальпый размер ДНК-вставки, которую может переносить ретровируспый вектор, — примерно 8 т. п. и. ДНК ретровирусного вектора можно использовать для трансформации клеток саму по себе, но эффективность поставки ее в ялро и интеграции в геном клетки-хозяина крайне низка. Поэ- Генпаи терапии 489 тому была разработана методика упаковки полноразмерной РНК ретровирусного вектора в иптактные вирусные частипы, с высокой частотой проникающие в клетку, что гарантирует встраивание соответствуюп«ей еи ДНК в геном клетки- хозяина.
Для этого с помощью генной инженерии бьща созлана «пакующая» клеточная ли««ия, в одном из участков генома которой содержится Л«у -сегмент 5'-(ТК-лад-3 -П К (т. е. сегмент, лишенный функциональной «у -последователь- ««ости), а в другом — Л«у'-сегмент 5 -1 Тй;ройеле- 3'-П К Оба этих сегмента транскрибируются, но из-за отсутствия «1>«-последовательности и образования вирусных молекул РНК меньшего, чем в норме, размера формиру>отса пустые вирусные частицы. При трансфекции ДНК ретровирусного вектора в такие клетки она встраиваетси в хромосомную ДНК и транскрибируетсн с образованием полноразмерной РНК ретровируса, содержащей «у -последовательность. В таких условиих в вирусные капсиды упаковывается только РНК вектора. Образующиеся интактные вирусные частицы можно исгюльзовать для высокоэффективной доставки ретровирусного вектора в клетки-мишени (рис. 21.4).
В «пакукипей» клеточной линии не образуются компетентные по репликации ретровирусы дикого типа, способные встраиватьси в гены и приводип к некотролируемой пролиферации некоторых клеток (т. е. к превращению их в раковые клетки). Это весьма существенно, особенно если часп«шы ретровирусного вектора предполагается использовать для «еной терапии соматических ю>еток человека. В качестве меры предосторожности все же проводят регулярное тестирование готовых ретровирусных векторов, с тем чтобы выявить ретровирусы дикого типа. Кроме того, в «пакующей» клеточной линии нуклеотидные последователып>сти ретровируса и вектора локализованы в трех разных областях хромосомы, что делает весьма маловероятной возможность последовательных рекомбинационных событий, которые могли бы привести к образованию компетентного по репликации ретровируса.
Ретровирусы активно инфицируют реплицирукхпиеся клетки. Для переноса генов в интенсивно расгушие клетки-мишени последние обрабатывают очищен ными частицами упакован> юго ретровирусного вектора либо проводит их совместное культивирование с производящси его клеточной линией, а затем осуществляют лифференциальную селекцию лля разлеления клеток-мишеней и «пакующих» клеток.
Транслуцированпые клетки-мише««и (те, в которые при помощи вируса была перенесена невирусная ДНК) тестируют, чтобы удое говериться, по: 1) в них синтезируется продукт терапевтического гена; 2) не образуются компетентные по рспп икации рстровирусы; 3) ДНК ретровирусного вектора пе встроилась в сайт, изме>шк>щий способ««оотг клеток к росту либо препятствующий их нормальному функционированию. После тестирования трансдупировшшыс клетки наращивают в болыпих количествах и с разными интервалами вволят пациенту, Наиболее вероятными кандидатами для проведения генной терапии ех «что (рис.
21.5) ивлякпси пациенты с наслелственными заболеваниями, лля лечения которых применяют трансплантацию и>- стного мозжи Терапевтический эффект трансплантапии костного моз> а в оп кипении целого ряда болезней связан с наличием в нем тотипотентных эмбриональных стволовых клеток, которые встречаются с частотой 1О « — 1О ', могут пр«>л>иферировать и дифференцироваться в различные типы клеток, такие как В- и Т-лимфоциты (В-клетки и Т-клетки), макрофаги, эритроциты, тромбоциты и остеокласты. Например, в том случае, когда генная мутация нарушает функции макрофагов, транс- план гапия костном> мозга обеспечивает реципиенту посто>ди«ый запас компетентных макрофа>ов, происходящих из популяции тотипотентных сгволовых клеток.
Ге>«ноинженерная модификации тотинотептных стволовых клеток с их последующей инфузией или трансплантацией пациенту для замещения утраченного типа клеток или генного пролукта может стать основным способом генной терапии ех «1«о. В качестве примера можно рассмотреть дефект ЛДЛ, приволяший к повышению в крови уровня адснозина и дезоксиаденозина, токсическое лействие которых приводит к гибели В- и Т-лпмфоцитов и развитию тяжелого иммунодефицита. Поскольку и В-, и Т-лимфоциты происходят из тотипотентных стволовых клеток, перенос в последние функционального гена ЛДЛ с поспеду>оп«им введением Питоплазма пия Питоплазма Проауцирующвя кле гол яая линия Полноразмерная векторная РН К 49б ГЛАВА г! «Пакующвя клеточная линия ДНК резргщирусного вектора у-)ТК Ч Ген Х Нес' умбтй пакованпвя РНК егровирусного вектора Рис. 21.4.
Получение упакован! !ого рстровируспого вектора. В двух разных участках хролюсом «пакующей» клеточной линии содержатся рстровируспыс гены: в одном — Кпу, в друп>м — ро( н елт. Их транскрипция контролируется 5 -ЕТВ-промоторолг; оба учаспьз лишены последовательности, необходимой для упаковки (гг!)г'). «Пакующая» линия клеток синтезирует вирусные белки, но из-за отсутствия в любой из ретровирусных мРНК последовательности, ответственной за упаковку, образуются пустые вирусные капсилы. После трапсфеюгии пакуюшей» линии клеток ретровирусным вектором, содержащим необходимую для упаковки последовательность (гу+), его полноразмерные РНК транскрибируютсг! и упаковываются в капсиды.
Высвобождаемые вирусные частипы не способны реплгшироваться и в даю юм случае содержат «терапевтический» ген (Гон Х) и селективный маркерный гоп (Мео'). Генная терапия 491 АДА-зависггл~ый тяжелый комбинированный иммунодефицит Адре~ вшеикоднсзрофия Синдром Чеднака — Хисаси Хрони ыский ~рьнулеьцпоз Анемия Фанкони Болезнь Гоше Дефицит ар! -! !5 Дефицит акгннв в гранулоцитвх Болезнь Хаюера Синдром Гурдерв А!рануло!!итоз новорожденных (детский а~ранукоггитоз) Болезнь Марото — Лами (мукоповисахаридоз Ч! зппа) Меч«хроматическая дейкодистрофив АДА-независимый тяжелый ломбнпиросвнный иммуподефипгп Остеопороз Де«1гиггит пурипфосфоридазы Рю икудярная дне пдазия Синдром Санфидиппо Серповиднокдеточная апемггя тгпассемия Синдром Вископа-Сцшрнча Х-спепденнав агаммагдобуднпемия Рис.
21.5. Наследственные заболевания, ддя лечения которых применяют трансплантацию костного мозга. их пациенту способствует понижению а крови уровней аленозина и дезоксиаденозииа и преЛотярашает разрушение В- и Т-лимфоцитов. Стволовые клетки можно получить ат самого пациента (оптимальный вариант) или от совместимых донороа, которых обычно нелегко найти. К сожаленикз, тотипотентные стволавые клетки очень трудно выделять из костного мозга и культивировать. Исследования ио ех ч(чо-генной терапии 8С1Г), вызванного дефицитом АДЛ, проводили иа аутологичных Т-клетках, модифицированных с помощью ретровирусных векторов.
Т-лимфоциты имеют ограниченное время жизни, поэтому необходимо проводить их повторные инфузии. В первом испытании двум деночкам вливали с интервалом а несколько месяцев собственные генетически «испранленныев Т-клетки, пролуиируюгцие АДА. Наблюдаемый положительный эффект, возможно, объяснялся снижением уровня аденозина и дезоксиаденозииа а крови и предотвращением гибели В- и Т-клеток.
Т-клерки — не оптимальная система доставки, прил)еняемая при генной терапии заболева- ний гелюпоэтических (происходящих из костного мозга) клеток. Предпочтительнее (хотя это не всегда возможно) использовать пуиояиипую кровь, содержащую стаолояые клетки. Так, при однократном введении новорожденным с дефицитам АДА С034«-клеток, полученных из их пупавинной крови и трансдуцирааанных кДНК АДА, эта кДНК поддерживалась и экспрессировалась я клетках крови неэритроидного ряда как минимум 18 мес.
В качестве ирилгера успешной геннои терапии ехч)чо с исиользаваниел! аутологичных клеток можно привести случай с пациенткой, гомозиготной по рецессивному гену семейной гиперхалестеролемин. Ее гспатоциты были лишены рецепторов липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и не разрушали холестсрол; он постоянно циркулировал я крови, приводя к закупорке артерий и тяжелой болезни сердца. Лекарственные средства в иалобных случаях неэффективны, а шунтирование коронарных артерий дает непродолжительный эффект.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
