Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 143
Текст из файла (страница 143)
20.29). Его суть состоит в Молекулярная генетика человека Вставка :Эюон 1 Экзон 2 Вектор .' | Трансфскция, транскрипция Первичный транскрипт Пропсссированный трапскрипт АААААААААААААА | Обратная транса!зипция ТГГ1"ГГГГгт ПТТ Первая цепь кДНК | Синтсзпнк на парной цепи кдНК тп'тГп 1 и т и т Р! Синтсз 21! !К на Р1-праймированной цепи Р2 АААААААААААААА ПЦР-продукт Рис. 20.29. (Продолэсение) Б. В полилннкср вскюра для уззавливания экзонов нстроен фрагмент ДНК человека, и эта конвлрукцня паслена в эукариовическуку клетку (транс!даниил). В ланном случае экзон содержит фупкпиональные акцепторный и донорный сайты сплайсин!а.
Прн процессинге первичного вранскрипта удаляютея интроны, фланкирующие экзон А, и он оказывается между экзонамн ! и 2. Длина ПЦР-нродукга обратного трапскрипта показывает, «пойман» ли искомый экзон между экзонами ! и 2 и, следовательно, содержит ли его данная вставка. следуклпем.
ДНК геномного клона расщепляют так, чтобы получить фрагменты длиной 1 — б т. и. н. „ и клон нрузот эти фрагменты в специально сконструированном векторе. Сайт множественного клонирования (полилинкер) вектора расположен внутри интрона, фланкиронанного двумя экзонамн (экзон ! и экзон 2). Этот искусствен- ный ген (экзон ! — интрон — экзон 2) находится под контролем сильного эукариотическо!о нромотора и может реплицироваться в сч сей или в культуре клеток млекопитающих. ! )осле введения (трансфскции) вектора без вставки в клетку млскопнтающего происходит транскрипция искусственного гена и удаление интрона из пср- 476 ГЛАВА 20 вичного транскрипта.
Процессированную РНК (экзон 1--экзон 2) можно выявить, проведя П ЦР-амплификацию обратного транскрипта. Сначю|а с помощью обратной транскриптазы на мРНК синтезируют ДНК (синтез первой цепи). Вторуву цеш синтезируют при участии праймера, комплементарного части экзона 1 первой цепи. Затем в реакционную смесь лобавляют второй праймер, комплементарный части экзона 2 второй цепи ДНК, и проводят ПЦР-амплификацию. Длину ПЦР-продукта определяют с помощью гель-электрофореза. Если в вектор встроить рестрикпионный фрагмент, содержащий некий экзон А и фланкирузшпие его интроцы, то после трансфекции процессированный транскрипт будет содержать три экзона: экзон ! — зкзон А — зкзон 2. Длина ПЦР-продукта будет болыле, чем в тех случаях, когда в векторе нет вставки, когда вставка содержит экзон без функциональных сайтов сплайсинга (донорно| о и акцепторно~ о) или когда вставка вообще не содержит зкзона.
Если во вставке присутствует более одного экзона, каждый из которых имеет функциональные сайты сплайсинга, то нроцессированный транскрипт будет содержать все эти экзоньь В том случае, если в каждом праймере солержатся рестрикционные сайты, клонируют ПЦР- продукт, несущий «пойманный» экзон, и используют последний в качестве зонда Лля скрининга кДНК-библиотеки. Зная нуклеотидную последовательность «пойманного» экзопа, предпринимают поиск гомологичных ему последовательностей в базе данных. Если есть основания полагать, что «пойманный» экзон с большой всроятносп ю является частью гена данного заболевания, то характеризуют и секвенирукл геномшяе клоны, охватывающие место расположения ланного гена, и исследуют образцы ДНК больных и здоровых индивидов с целью выявления мутаций.
Поскольку мутаггии„ответственньге за патологию, не всегда бывают равномерно распределены по всем экзонам, чем болыис размер сканированной копирующей области предполагаемого гена, тем больше вероятность обнаружения мутации. Для идентификации экзонов используют различные компьютерные программы, например ОКА1Е (Оспе Кесояп!!!оп ап«1 Апа1уаЬ 1п!егпе! Е!пс). Онп созданы исходя из некоторых характерных для экзона особенностей. Одна нз них — ожилаемая нуклеотидная последовательность кодируюшей области. Если лаборатория оснащена оборудованием для широкомасштабного секвенирования, можно секвенировать геномные клоны, охватывающие область расположения искомого гена, и провести компьютерную обработку полученных данных с целью выявления экзонов.
Нуклеотидную последовательность предпола1аемого экзона можно использовать для поиска гомологичных е!1 последовательностей в генной базе данных или синтезировать на ее основе олигонуклеотидный зонд для скрининга кДНК-библиотеки. Наконец, как и в случае других методов идентификации экзонов в геномных клонах, необходимо доказать, что предполагаемый экзон является частью 1ена-мишени. Реализация любого проекта по позиционному каргироваиию гена занимает много времени. За период с 1986 по !995 г. с помощью данного подхода удалось обнаружить более 50 генов различных заболеваний человека, что можно считать болыпим достижением.
Иногда поиск гена занимает 1 — 2 года, в то же время для обнаружения гена хорси Гентингтона консорциуму из нескольких исследоватсльских лабораторий потребовалось 10 лет. Отметим, что с клонированием все новых и новых генов и построением трапскрипционпых карт с высоким разрешением позиционное картирование постепенно уступает место позиционно-кандидатному. Позиционно-кандидатное картирование Позиционно-кандилатное картирование состоит в определении хромосомной локализации гена болезни, продукт которого неизвестен„и последукяпем анализе современных генетических и транскрипционных карт, с тем чтобы выявить кодирующие последовательности (гены, внутригенные ЕЯТ), находящиеся в этом же районе (рнс.
20.30). Весьма вероятно, что одна из этих последовательностей и окажется геном данного заболевания. Если какой-либо из генов-кандидатов охарактеризован, можно провести его мутационный анализ. Как альтернативу можно использовать «канлидатные» ЕЯТ в качестве зондов, отобрать с их помощью геномный клон и секвенировать его, а затем также провести му- Молекулярная генетика человека 477 .; с,ючнбсгьмгда хвам«сам!соса свйв( .:!! Й$ТГвйолпанхсй в там жбе:райан«: Мущцг!Оцный';-',', - Отбор в,характер(сствхз ,,:" 'анасвз, с: - - ".- ',, '..: 'тенбмныхюзбяов-... Му!«циаме Рве.
20ЗО. Позипнонно-кандидатнос карл ированне. Идснзнфикация гена заболевания в том случае, когда продукт гена неизвестен, но ген картирван в том же хромосомном районе, по и некоторые функииопальныс гены и Е8Т. Из эгих генов и ЕВТ спбирают «капдидатные» и опрслсляк1т, какие из них соотвезствуют искомому сену. тациоиный анализ. По мере детализации физических и транскрипционных карт позипионнокандидатное картирование становится всс более популярным при поиске генов различных заболеваний человека.
Прогрвммв «Геном человека» Работа над реализацией программы сй сном человека» (НС Р, Нишап С епоспе Рго)ес!) официально началась 1 октября 1990 г. в США и контролирует ее Министерство энергетики (()ерап1пеп! оГ Епегяу) совместно с Государстве~ными и~1ститутами здоровья ()Ка1!опа! 1пвришев ор Неа!Еб) США. Ее конечная цель состоит в определении нуклеотндной послеповатсль~ости всего генома человека. Полученная обширная генетическая информация станет основой для более узких проектов исслелования всех моногенных ~енетических заболеваний и послужит трамплином для изучения сложных наследственных патологий.
В !990 г. предполагалось, что раГюта в рамках НСсР займет 15 лет, а ес стоимость составит 2 млрд. долл. За короткое время программа стала международной, ее проекты финансируются правительствами Великобритании, Франции. Каналы, Германии и Японии. В настояшее время происходит кооперация и координация усилий многих государственных и межгосуларственных агентств, частных компаний и некоммерческих исследовательских институтов.
НОР— обширная программа, охватываюгцая множество различных направлений. Та часгь программы «Геном человека», которая выполняется в США, включает следующие подпрограммы: построение генетических и физических карт с высоким разрешением; снижение себестоимости н 1ювьппенис эффективности крупномасштабного секвснирования ДНК; разработка новых технологий картирования генов и секвенирования ДНК; усовершенствование компьютерных технологий лля обработки и хранения болыпнх массивов ланных; изучение этического, правового и социального аспектов исследований, проводимых в рамках программы.
Цель последней подпрограммы состоит в создани руководств для исслелователсй и врачей и обосновании политики правительства, касавшейся использования гснетической информации. В рамках подпрограммы «Новые технологии» консорциумом нескольких групп исследователей был полностью секвенирован геном дрожжей Басс)сагаспусез сегеа7з7ае (150 и.
п. н.). Кроме того, определены полные нуклеотидные послеловательности ДНК других «модельных» организмов, таких как нематоды (СаепагЬаЬс)(гсУ е!сяапз, 100 м. и. н.), плодовая мупска (ВгазауЫа те!ападазгег, 120 м. и. и.), бактерии (Е.
сауд 4,2 т. и. н.), мышь (Миг гпазси!из, 3000 м. п. н.). Некоторые из намеченных на период 1990 — ! 995 гг. залач той части НГ) Р, которая выполняется в США, в 1993 г. были пересмотрены; это связано с быстрым про!рессом в генетическом картированни благоларя внедрению микросателлитных полиморфных маркеров и построению практически полных физических карт. К 1996 г. улалось решить несколько вновь поставленных задач. Например, в 1994 г, была опубликована карта (гснегического) сцепления человека, которая содержала 5826 покусов, охватывающих 4000 сМ.
Хотя только для 908 покусов шансы сцепления составили больше !000:1, ко- 478 1'ЛАВА 20 печная плотность маркеров равнялась 0,7 сМ (4000 сМ/5826 локусов), что больше ожидаемой в 1995 и плотности карты 2 — 5 сМ. К !996 г. было запланировано построение физической карты, основанной па 8Т8, с ра:язсшением 300 т. п.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
